标准储备菌株纯度确认标准操作规程.pdf

标标准准储储备备菌菌株株纯纯度度确确认认标标准准操操作作规规程程 1.⽬的：建⽴标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和⽣长特性的 变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2.范围：微⽣物限度实验室所⽤标准储备菌株。。 3.职责：QC主管⽣测员对本规程的实施负责。 4.依据：中国药典2015年版四部通则。 5.内容： 5.1.实验菌株 5.1.1 标准菌株 5.1.1.1 标准菌株应来⾃认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中⽣长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3 标准储备菌株应进⾏纯度和特性确认。 5.1.2 ⼯作菌株 5.1.2.1 标准储备菌株可⽤于定期转种 （每3个⽉）或制备⼯作菌株。 5.1.2.2 ⼯作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代 （从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防⽌过度的传代增加 表型变化的风险。因此必要时，应对⼯作菌株的纯度和特性进⾏确认。 5.2 菌种确认试验的主要内容 5.2.1 菌种的纯度确认 5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的⽅法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2 实验内容 ⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，⽤⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜 ⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现 相同特征。 ⑵镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2 菌种的特性确认 5.2.2.1 ⽣化试验 各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不 同的⽣化特征。根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。 5.3 菌种的确定⽅法 ⽤⽆菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌 落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。再做⽣化试验或使⽤菌种鉴定系统进⼀步鉴定 菌种。 5.3.1 ⼤肠埃希菌的确认 5.3.1.1 菌落形态 ⑴取⼤肠埃希菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24⼩时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物 有粪臭味。 ⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24⼩时后，观察结果。 ⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红⾊或微红⾊，菌落中⼼呈深桃红⾊，圆形，扁平，边缘整齐，表⾯光滑，湿润。 5.3.1.2 ⾰兰染⾊、镜检 ⑴⾰兰染⾊ 以接种环沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取麦康凯琼脂平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次 ⼲燥固定。 滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。 滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。 滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。 滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。 ⑵染⾊结果：⾰兰阳性菌呈蓝紫⾊；⾰兰阴性菌呈红⾊。 ⑶镜检结果：两端钝圆的短⼩直杆菌，单个或成对，⾰兰阴性，⽆芽孢，多有鞭⽑。以周⾝鞭⽑运动或不运动，许多菌株有荚 膜和微荚膜。 5.3.1.3 ⽣化试验 ⑴靛基质试验 (I) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于蛋⽩胨⽔培养基，培养24～48⼩时，沿管壁加⼊靛基质试液数滴，轻轻 摇动试管。液⾯成玫瑰红⾊为阳性，呈试剂本⾊为阴性。98%的⼤肠埃希菌靛基质试验为阳性。⼀般24h即可出现阳性结果， 以⽆菌操作先从管中取出1或2ml培养液进⾏检查，如靛基质是阴性，余下的蛋⽩胨⽔培养基再培养24h，作靛基质试验。 ⑵甲基红试验(M) 取麦康凯琼脂平板上的菌落,接种于缓冲葡萄糖胨⽔培养基,培养48±2⼩时,于培养液中加⼊甲基红指⽰液2～3 滴 （约每1ml培养液加指⽰液1滴），轻微摇动，⽴即观察。液⾯成红⾊或橘红⾊为阳性，呈黄⾊为阴性。 ⑶⼄酰甲基甲醇⽣成试验(V-P) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于缓冲葡萄糖胨⽔培养基,培养48±2⼩时，于2ml培养液中加 ⼊α-萘酚⼄醇试液1ml,混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml, 充分振摇，在30分钟内出现红⾊为阳性，⽆红⾊反应⾊为阴性。 ⑷枸橼酸盐利⽤试验(C) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于西蒙⽒柠檬酸盐琼脂培养基斜⾯上，培养2～4天。培养基斜⾯上 有菌苔⽣长，培养基由绿⾊变为蓝⾊时为阳性，培养基颜⾊⽆ 变，⽆菌苔⽣长为阴性。 ⑸乳糖发酵试验取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于乳糖发酵管，培养⼩时，观察产酸 （指⽰剂为酸性