16SrDNA-PCR扩增标准操作规程.doc

目的 建立和规范16SrDNA扩增操作程序。 责任 16SrDNA扩增实验人员。 适用范围 适用于单菌和基因组16SrDNA扩增操作。 术语和定义 无 操作步骤 试剂：10× PCR Buffer；dNTPs；sgR；sgF；r-Taq酶；PCR模板：待测混合菌；ddH?O。 菌悬液制备：超净工作台灭菌后点燃酒精灯，取出灭过菌的1.5mL离心管，做与菌号相应的编号，吸取30μL ddH?O,在火焰附近用灭过菌的牙签或枪头挑取单个菌并于水中吸打混匀，使成有一定浊度的菌悬液。 菌悬液的预处理：将菌悬液置-20℃冰箱中15min，取出，再将菌悬液置65℃水浴锅放10min；反复冻融三次后，在掌上离心机上离心10s。 基因组样品的预处理：将提取好的基因组用灭过菌的ddH?O稀释10倍，混匀离心，取其稀释液进行PCR扩增。 配置样品PCR反应溶液 PCR反应体系 组分 1次反应所需用量（μL） n次反应所需用量（μL） ddH?O 18.2 18.2×（n+1） 10× PCR Buffer 2.5 2.5×（n+1） dNTP 2.0 2.0×（n+1） sgR 0.5 0.5×（n+1） sgF 0.5 0.5×（n+1） r-Taq酶 0.3 0.3×（n+1） 模板 1.0 总体积 25.0 在超净工作台中，取1.5mL或2 mL离心管放置在冰盒上，根据PCR反应体系各溶液量，计算所需各溶液用量，按ddH2O、10× PCR Buffer、dNTP、sgR、sgF、r-Taq 酶的顺序加入离心管中（不加模板），配制完成后，振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒。 分装：PCR反应混合液（未加模板）配置后，用移液器吸取24μL分装至200μL的离心管中。 加模板：将制备好的菌悬液（基因组稀释液）用移液器吸取1μL加入上述分装好的混合液中；其中一支分装后的PCR混合液加入1μL的纯化水做阴性对照。 PCR扩增：将配置的样品PCR反应液放PCR仪内，按照《PCR使用操作规程》设置程序，进行PCR扩增反应： 1.不可梯度降温的PCR反应体系 94℃ 5min 94℃ 30s 10cycles 60℃ 10cycles 72℃ 1min30s 94℃ 30s 25cycles 56℃ 25cycles 72℃ 1min30s 72℃ 10min 4℃ ∞ 2.可梯度降温的PCR反应体系 94℃ 5min 94℃ 30s 10cycles-0.4℃ 60℃ 10cycles -0.4℃ 72℃ 1min30s 94℃ 30s 25cycles 56℃ 3 25cycles 72℃ 1min30s 72℃ 10min 4℃ ∞ PCR下机及电泳检测：样品PCR扩增程序运行结束后，取出样品，取3uL按《电泳标准操作规程》进行电泳检测，检测后若条带单一明亮，则进行磁珠纯化。 磁珠纯化及电泳检测 按《PCR产物磁珠纯化标准操作规程》将检测后的PCR产物进行磁珠纯化后，取3uL按《电泳标准操作规程》进行电泳检测，检测后若条带单一明亮，进行3730测序。 相关文件 电泳标准操作规程 相关记录 无 8 参考文献 无 9 附录 附录1：缩写词表 附录2：主要设备一览表 附录3：主要试剂和耗材一览表 附录A ：修订记录表 附录1 缩写词表 缩写词 全称 对应中文翻译 SOP Standard Operation Procedure 标准化操作流程 PE Paired-End Library Paired-End文库 bp base pair 碱基对 BAC Bacterial Artificial Chromosome 细菌人工染色体 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 T4 PNK T4 PolyNucleotide Kinase T4多核苷酸激酶 ts Tests 次（试验） m Meter 米 cm Centimeter 厘米 mm Millimeter 毫米 EB Ethidium Bromide 溴化乙锭 PE* PolyEthylene 聚乙烯 g Gram 克 mg Milligramme 毫克 μg Microgramme 微克 ng Nanogramme 纳克 ml