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实验二十 纸层析法分析氨基酸
一、实验目的
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。
2.了解氨基酸的特征性颜色反应。
3.学会分析未知样品的氨基酸成分。
二、实验原理
纸上层析法是分配层析法中的一种,常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便,使用样品少,分离效果好,为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。
纸上层析的原理,常以水和有机溶剂作为展层剂;水和有机溶剂互溶后形成两个相:一个是饱和了有机溶剂后的水相,一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力,而与有机溶剂的亲和力相对较弱,因此我们认为水相为固定相,有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随有机相移动较快;而极性大的物质在水相中分配较多,移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开。一般来说,在相同的条件下,每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为:Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/(原点到溶剂前沿的距离)
影响Rf值的因素有:①物质本身的化学结构;②展层所用溶剂系统;③展层剂pH值;④展层时的温度;⑤展层所用滤纸;⑥展层的方向(横向,上行或下行)。
用纸层析鉴定样品时,一般都与标准品相比较。若没有标准品,可选择文献记载的该物质层析条件,根据文献Rf值进行鉴定。
三、实验用品
1.材料 氨基酸
2.器材 层析缸、烘箱、冷热电吹风机、毛细管、针和线、培养皿。
3.试剂
(1)展层剂和平衡液
正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5,充分摇匀,用分液漏斗取上层液作展层剂;下层液作平衡液。
(2)样品液
用水配成每ml含有苯丙氨酸、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸各4 mg的4种氨基酸溶液,以及上述4种氨基酸的混合液(各4 mg/m1)。苯丙氨酸不易溶解于水,应稍微加热使之溶解。
(3)茚三酮
按展层剂O.25%的比例将茚三酮加入展层剂中,使其溶解。
四、实验操作
1.纸的处理
取25 cm长、15 cm宽的滤纸一张,离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线,并等距离的在线上定点样点(原点)划圈,使圈的直径小于0.5 cm。
2.点样
在每个圈下用铅笔记上每种氨基的代号(混合样可写M),然后用毛细管吸取样品,轻轻地点到相应的氨基酸圈内,待晾干或用冷风吹干后再点2次。每个样品共点3次。
3.饱和
将点好样的滤纸纵向卷起来,点样面向里,点样点位于一端,用针线缝成筒状,不要使滤纸两边接触(见图20-1),然后将滤纸直立于层析缸中。在层析缸内培养皿中预先放入平衡液。滤纸筒放在培养皿周围饱和1小时。
4.层析
图20-1滤纸的缝合
将培养皿中放入2/3量的展层剂,转移到另一层析缸中。把饱和过的滤纸筒转移到此培养皿内,样品端向下垂直放置,切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达离上端3cm处,取出滤纸,用铅笔描出溶剂前沿,晾干。
5.显色
将晾干滤纸放入烘箱中(105℃),烤几分钟后,滤纸上即显出氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见
6. 结果处理
用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离,计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。
图20-2层析谱
. 1.原点;2.层析点;3.溶剂前沿
六、实验建议
(1)在整个操作过程中,手只能接触滤纸边缘,否则手指上氨基酸会造成滤纸上众多斑点。
(2)在点样时,不要将毛细管插错了试剂瓶。
(3)展层结束后,切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。
(4)点样斑点不能太大(其直径应小于0.5cm),防止氨基酸斑点重复;吹风温度不宜过高,否则斑点变黄。
(5)根据目的、要求,选择合适溶剂系统。
七、实验报告及作业
1.计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。
2.氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这种显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色?写出这种显色剂与氨基酸反应的反应式。
3.氨基酸纸上层析的固定相和流动相各是什么?
4.Rf值的意义是什么?根据我们做的实验,说明几种标准氨基酸的Rf值为何不同?
(孔小卫 余嗣明)
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