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第七章色谱分离技术
; 随着科学的进步,某些关系到人们生命安全的生物药品,尤其是注射药品和生物工程产品等,都需要高度纯化。但是,经典的分离方法(如萃取、结晶等)很难满足需要。
色谱法应运而生。; 色谱分离是一组相关技术的总称,又叫做色谱法、层析法,是一种高效而有用的生物分离技术。
是产品的最后纯化工序(精制),即在用色谱纯化之前需要经过其他方法进行提取和初步纯化。
近40年来,色谱技术已成为生物大分子分离和纯化技术中极重要的组成部分。
胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长激素等。;概述;色谱法的发展历史;色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作;色谱分离基本原理:
使用外力使含有样品的流动相(气体、液体或超临界流体)通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份与两相进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢,而与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异,使得混合组份最终形成各个组份的“带(band)”或“区(zone)”,对依次流出的各个组份物质可分别进行定性、定量分析。
; ;色谱分类方法;按流动相,可分为:
气相色谱法
液相色谱法
超临界色谱法
按固定相物态,气相色谱法可分为:
气固色谱法
气液色谱法
按流动相物态,液相色谱法可分为:
液固色谱法
液液色谱法;色谱分离技术;按色谱动力学过
程,可分为:
洗脱色谱
顶替色谱
迎头色谱;按组份在固定相上的物理化学原理,分为:
吸附色谱:不同组份在固定相的吸附作用不同;
分配色谱:不同组份在固定相上的溶解能力不同;
离子交换色谱:不同组份在固定相(离子交换
剂)上的亲和力不同;
凝胶色谱:(尺寸排阻色谱):不同尺寸分子在固
定相上的渗透作用;
;色谱法的特点;; 一、概述; 2.色谱法的特点; 流动相流经固定相时,由于物质在两相间的分配情况不同,经过多次差别分配而达到分离;或者说,易分配于固定相中的物质移动速度慢,易分配于流动相中的物质移动速度快,??而逐步分离。; (2)基本特点:
① 分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高的,这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。
② 应用范围广。(非)极性、(非)离子型、小分子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热(不)稳定化合物;尤其是对生物大分子的分离,其他方法无法取代。
③ 选择性强。可变参数很多:不同的色谱分离方法、固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单,操作方便,且不含强烈的操作条件,因而不容易使物质变性,特别适于不稳定的大分子有机化合物。; 缺点:
处理量小、操作周期长、不能连续操作,因此主要用于实验室,工业生产上应用较少。; 3.色谱法的分类; 4.色谱分离方法的选择; 色谱分离方法的选择依据:
① 目的产物的分子结构、物理化学性质及相对分子质量;
② 主要杂质,特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质成分与含量;
③ 目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳定性。; 二、吸附色谱法; (一)基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时,分子会贴在固体表面上,发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理:
固体表面分子(或原子)与固体内部分子(或原子)所处的状态不同:
固体内部分子(或原子)受临近四周分子的作用力是对称的,作用力总和为零,即彼此互相抵消,故分子处于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称,作用力总和不等于零,合力指向固体内部。; 2.吸附的类型:
;物理吸附 化学吸附; 交换吸附:
吸附剂表面如果由极性分子或离子组成,则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层,同时放出等物质的量的离子,发生离子交换。
离子的电荷是决定因素,离子所带电荷越多,在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。
电荷相同的离子,水化半径越小,越容易被吸附。; 3.常用的吸附剂:
;;(2)分类; 5.吸附薄层色谱法
(thin layer chromatography, TLC)
薄层色谱法:将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上,铺成一薄层,然后把要分离的样品点到薄层的起始线上,用合适的溶剂展开,最后使样品中各组分得到分离。; (1)原理:
利用混合物中各组分的物理化学性质的差异,在层析过程中,在不相溶的两相中分布不同,从而达到分离的目的。; 将待分离的样品溶液点在薄层板的一端,在密闭的容器中用适宜的溶剂(展开剂)展开。; 当溶剂流过时,不同物质在吸附剂和展开剂之间发生连
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