实验八_考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.doc

实验八 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 一 实验目的 学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 二 实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 三 实验器材 （1）旋涡混合器。 （2）试管1.5cm×15cm（×8） （3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。 四 实验试剂 1、9％NaCL溶液。 2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。 3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。 4、样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。 五 实验方法 （一）标准曲线的制备 1、取7支干净试管，按表15进行编号并加入试剂。 2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。 表15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备 试剂 管号 1（空白） 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度（g/ml） A595nm — 1.0 4.0 0 0.1 0.9 4.0 10 0.2 0.8 4.0 20 0.3 0.7 4.0 30 0.4 0.6 4.0 40 0.6 0.4 4.0 60 0.8 0.2 4.0 80 （二）样品的测定 另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 注意 样品蛋白质含量应在10-100ug为宜。一些阳离子如K+ 、Na+、Mg+、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。 六 注意事项 研究表明，NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min-1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定吸光度，因为在这段时间内颜色最稳定。 测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100-800ug/ml为宜。 七 思考题 Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？ 为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度？