荧光定量PCR操作流程.doc

荧光定量PCR操作流程 目的基因引物的合成 设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。 2 总RNA提取 （1）准备 研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、 手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷 2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆； 3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月） 4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟； 5）12000g，15min，4℃； 6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟； 7）12000g，10min，4℃； 8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤； 9）12000g，5min，4℃； 10）取沉淀，室温干燥10min； 11）溶解于DEPC处理水中 12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。 3 反转录（TOYOBO试剂盒） Nuclease-free water up to 10ul 5ⅹRT buffer 2ul RT Enzyme Mix 0.5ul Primer Mix 0.5ul RNA 0.5-1ug 10ul 37℃ 37℃ 水浴15min 98℃ ，5min水浴使酶失活 反应结束，保存于4℃或者-20℃条件下备用（一般定量PCR时稀释20倍） 定量PCR反应（本实验室7300系统） SYBR 10ul Forward Primer 1ul Reverse Primer 1ul ROX Ⅰ 0.4ul c DNA模板 2ul d H2O 5.6ul 20ul 一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。