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erkmapk信号传导通路异常激活与鼻咽癌细胞增殖凋亡的关系 丝绸原激活蛋白激酶（migen-a活泼蛋白激酶（mgk））是真核细胞中的一个重要的信号调导系统。属于丝氨酸酪氨酸酶，可由多种刺激（如细胞因子、生长因子、神经纤维等）激活。激活后，可以激活核内的各种基因（如编码因子、其他蛋白激酶等），以调节相关基因的表达，并参与各种生理过程，如细胞分裂、复制、移动和死亡。目前,在哺乳动物细胞中已发现MAPK通路中4个亚家族,即细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK/SAPK)、p38 MAPK和ERK5/BMK1(big MAP kinase1)。ERK1/2信号通路与细胞的增殖和凋亡相关。本研究通过检测p-ERK、Cyclin D1和Ki-67在鼻咽癌及鼻咽黏膜上皮细胞中表达的意义和关系以及ERK信号通路阻滞剂PD98059对鼻咽癌细胞的影响,探讨ERK/MAPK信号通路与鼻咽癌细胞增殖凋亡的关系,以期发现鼻咽癌治疗的新途径。 1 材料和方法 1.1 肺癌病例选择选择 36例鼻咽癌标本和42例鼻咽黏膜慢性炎均取自人民解放军第四二二医院病理科2004-01-2007-12存档蜡块。鼻咽癌患者中,男28例,女8例。年龄24～76岁,中位年龄50岁。所有病例就诊前均未行放疗或化疗。所有标本均经10%中性甲醛固定,常规制片。人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞系为广东医学院病理学教研室保存。 1.2 免疫组织化学试剂 小鼠抗人磷酸化ERK及蛋白质印迹实验用Cyclin D1单克隆抗体为美国Santa Cruz 公司产品。抗小鼠IgG(HRP)二抗、兔抗人Cyclin D1、 Ki-67单克隆抗体及免疫组织化学试剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。每一批实验均设置阳性和阴性对照,阳性对照用已知阳性组织切片,阴性对照用PBS代替一抗。PD98059购自碧云天生物技术研究所,母液质量浓度为20 mg/mL。 1.3 免疫组织化学检测 设立不同对照组和实验组,按SP法试剂盒操作说明分别检测石蜡标本和细胞爬片标本中p-ERK、Cyclin D1和Ki-67蛋白的表达。 1.4 细胞形态学检测 设立对照组和实验组。实验组分别用10、50和100 μmol/L浓度的ERK信号通路阻滞剂PD98059处理CNE-2Z细胞,HE染色观察细胞形态学改变,Hoechst33342/PI荧光双染法观察细胞的凋亡,蛋白质印迹方法检测Cyclin D1基因的表达,免疫细胞化学方法检测p-ERK、Cyclin D1和Ki-67蛋白的表达。 1.5 细胞显色分级 对实验结果进行双盲法评估,综合染色强度和阳性细胞数量积分,按半定量方法判断。1)按显色深浅评分:0分为不显色,1分为浅黄色显色,2分为棕黄色显色,3分为棕褐色显色。2)按显色比例评分:显色细胞数≤5%为0分;5%～25%为1分;25%～50%为2分;50%～75%为3分;75%为4分。以上述2项乘积作为判断标准:0分为(-),1～2分为(+),3～4分为(++),5分为(+++)。p-ERK、Ki-67和Cyclin D1阳性表达定位于胞核。 1.6 统计方法 采用统计软件SPSS 13.0做四格表χ2检验及Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 鼻模拟的皮细胞 p-ERK、Cyclin D1和Ki-67蛋白在鼻咽癌细胞的阳性表达率分别为69.44%(25/36)、80.56%(29/36)和80.56%(29/36),在鼻咽黏膜上皮细胞分别为23.80%(10/42)、19.05%(8/42)和9.52%(4/42),两组间差异均有统计学意义,P0.01(图1)。 2.2 yclind、ki-97蛋白表达 36例鼻咽癌组织中,p-ERK与Cyclin D1、Ki-67蛋白表达呈正相关,r值分别为0.604和0.668,P0.01(表1)。 2.3 细胞水肿、胞膜破裂 10、50和100 μmol/L PD98059处理CNE-2Z细胞6 h可观察到细胞肿胀,边界不清;24 h见细胞质浓缩,细胞不同程度的皱缩变圆,折光性差,核染色质边集,部分细胞胞膜破裂。细胞碎片随药物浓度增加,呈现上述形态改变的细胞数量增加。 2.4 pahs对cne-2z细胞ki-97的表达的影响 免疫细胞化学法检测显示,CNE-2Z细胞空白对照组中p-ERK、Cyclin D1和Ki-67均呈强阳性表达。不同浓度PD98059分别作用于CNE-2Z细胞24 h后,可见p-ERK、Cyclin D1和Ki-67的表达下降(图2)。蛋白质印迹