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pi3kak通路调节肝癌干细胞样细胞对阿霉素的敏感性 近年来，肿瘤干肿瘤（csc）理论的提出为肿瘤的治疗提出了新的思路。肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中绝大多数细胞只具备有限增殖能力,对化疗药物产生抗性的仅是肿瘤中极少一部分细胞,即肿瘤干细胞,治疗如果不能杀死导致肿瘤形成并维持肿瘤生长的肿瘤干细胞,那么肿瘤仍会复发,故对肿瘤的治疗应针对肿瘤干细胞。继1994年Lapidot等首次发现了白血病肿瘤干细胞后,研究者陆续在脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等许多实体肿瘤中也成功分离出肿瘤干细胞。本研究采用无血清悬浮球培养方法分离、富集肝癌干细胞并且鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。 磷脂酰肌醇3激酶(P13Ks)信号参与增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节,研究表明,IA型P13K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt)所组成的信号通路与人类肿瘤的发生、发展密切相关,该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活。本研究应用球培养法富集肝癌干细胞亚群后,得到肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素的耐药性受到PI3K/Akt信号通路的调节。 1 材料和方法 1.1 细胞和主要试剂 1.1.1 细胞植物 人肝癌细胞株PLC8024、Hep G2、Hep3B购自中国科学院上海生命科学院细胞库。 1.1.2 免疫活性的检测 DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、人重组表皮生长因子(EGF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、B27(Invitrogen公司);胎牛血清(FBS,Gibco公司);超低吸附表面6孔板、普通6孔、96孔板(Coming Inc,Coming,NY,USA)。流式分选抗体CD90(德国Miltenyi公司);RIPA裂解液(强)、ECL化学发光显色试剂盒、SDS凝胶配制试剂盒(Beyotime公司);阿霉素、LY294002抑制剂(凯基生物);MTT试剂盒(Beyotime公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)。无血清条件培养基:以DMEM/F12为基础培养基,不添加血清,添加20 ng/m L EGF、10 ng/m L b FGF、2%B27、100 IU/m L青霉素、100 IU/m L链霉素;标记液:将Annexin V-FITC加入到PBS缓冲液中,使其终浓度为1μg/m L。 1.2 细胞强化和无血清条件培养基培养 以DMEM高糖培养基加10%FBS、100 IU/m L青霉素、100 IU/m L链霉素将PLC、Hep G2、Hep3B肝癌细胞培养于37℃、5%CO2孵箱中,待细胞长至80%密度时,用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,离心,弃上清,以无血清条件培养基重悬。细胞计数,以不超过5 000个/孔的密度接种于超低吸附表面6孔板,加无血清条件培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养。培养7～10 d,待细胞球长至约70μm大小,收集细胞悬液,将获得的细胞球用0.25%胰酶于37℃孵箱消化10 min,吹打分散成单个细胞,加PBS,800 r/min离心5 min,弃上清。再用无血清条件培养基将细胞重悬。计数细胞,5 000个/孔重新接种于超低吸附表面6孔板,37℃、5%CO2孵箱中培养。 1.3 cd29表达量检测 待肝癌细胞PLC细胞系长至80%密度时,用0.25%胰酶消化后离心去上清,细胞计数,每1×107细胞中加入100μL PBS缓冲液后加入10μL抗体,充分混匀,4℃避光孵育10 min,用流式细胞仪测定CD90在各组细胞中的表达量。分别采用此方法检测同型对照组、贴壁细胞组、细胞球组CD90表达量。待细胞长至80%密度时,分别加入不同浓度阿霉素2.5、5、10μg/m L作用于PLC贴壁细胞48 h后,流式检测膜分子标记物CD90表达量。 1.4 培养组非bs-bs基因型 收集PLC细胞球,消化为单细胞,同时收集生长至80%密度的贴壁细胞。计数板计数,将消化为单细胞的细胞球以1 000个/孔接种于6孔板中,接种3孔,贴壁细胞以相同密度接种至另外3孔。用含10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养,每4天换1次液。9 d后吸弃培养基,PBS洗3遍,4%多聚甲醛室温固定20 min,PBS冲洗3次。加结晶紫染色10 min,自来水冲洗。显微镜下计数大于60个细胞的克隆个数,拍照记录。 1.5 细胞球细胞接种pbs 4～6周雄性SCID小鼠购自上海中科院实验动物中心,消化、收集PLC细胞球和PLC贴壁细胞,细胞计数,PBS重悬,用100μL微量注射器在小鼠两侧前腿根部皮下分别注入细胞球细胞、贴壁细胞1、20万个,每只SCID小鼠保证两处接种细胞量相同,每组注射3只。每隔3～4天观察成瘤情况,待小鼠成瘤后,对所形成的瘤块拍照、测量、记录,取瘤块做石蜡包埋、组织切片,行HE染