基因工程原理第3章基因克隆载体.pptVIP

pBR322质粒是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，分子大小为（ 4.3kb），具有松弛型复制子，选择标记为（Amp）和（ Tet ）。 就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制区： 含有复制起点）；（选择标记： 主要是抗性基因）；（克隆位点： 便于外源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 载体的功能是（ d ） （a）外源基因进入受体的搭载工具 （b）不能为外源基因提供整合能力 （c）不能提供复制能力 （d）不能为外源基因提供表达能力 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体 （a）pSCl01 （b）pBR322 （c）pUBll0 （d）pUCl8 本文档共84页；当前第31页；编辑于星期二\12点25分 第七次课结束！ 本文档共84页；当前第32页；编辑于星期二\12点25分 4. TA载体 T T A A 本文档共84页；当前第33页；编辑于星期二\12点25分 本文档共84页；当前第34页；编辑于星期二\12点25分 5. 质粒表达载体 ——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。 本文档共84页；当前第35页；编辑于星期二\12点25分 lac启动子表达系统 本文档共84页；当前第36页；编辑于星期二\12点25分 质粒表达载体 融合型表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 本文档共84页；当前第37页；编辑于星期二\12点25分 融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图 融合蛋白表达载体： 融合蛋白：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转移产生的单一的多肽序列。 本文档共84页；当前第38页；编辑于星期二\12点25分 表达融合体蛋白质策略的优点： （1）克隆的外源基因能有效转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。 本文档共84页；当前第39页；编辑于星期二\12点25分 非融合蛋白表达载体： 本文档共84页；当前第40页；编辑于星期二\12点25分 二、噬菌体克隆载体 λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。 本文档共84页；当前第41页；编辑于星期二\12点25分 相关概念： 溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。 溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。 温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。 烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。 溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。 本文档共84页；当前第42页；编辑于星期二\12点25分 溶原性噬菌体的生命周期 a：噬菌体吸附到寄主细胞表面； b：噬菌体DNA注入寄主细胞； c：噬菌体大量增殖 d：子代噬菌体颗粒组装； e：寄主细胞溶菌； f：噬菌体DNA从寄主染色体DNA上删除下来； g：溶原性细胞按照正常速率分裂。 本文档共84页；当前第43页；编辑于星期二\12点25分 1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质 基因按功能相近性聚集成簇： 左侧区：A-J，合成头尾蛋白的全部基因 中间区：J-N，非必要区，与重组有关 右侧区：N-R，DNA合成及调控。 本文档共84页；当前第44页；编辑于星期二\12点25分 G+C=10 A+T=2 cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点 线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5单链突出序列，即粘性末端。注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5—P和3—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。 本文档共84页；当前第45页；编辑于星期二\12点25分 2. λ噬菌体作为构建克隆载体的依据 λ噬菌体是一种温和噬菌体 能承载比较大的外源DNA片段 存在多个限制性位点 本文档共84页；当前第46页；编辑于星期二\12点25分 3.