培养基的制备、使用、保存及相关疑难解答.docx

一：培养基的实验室制备 正确制备培养基时微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。 使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据，如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。 使用各别成分制备培养基时，应按照配方准确配制，记录所有细节信息，如;培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等，以便潮源。 1.水 除特定要求，实验室用水的电导率在25℃下应不高于25uS/cm(相当于电阻率≥0.4MΩcm)。 微生物污染应不超过103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。应根? GB/T5750.12?或其他有效方法，定期检验微生物的污染。 2.称量和复水 称量所需量的脱水培养基(即 干粉培养基，使用时注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物质的培养基粉末)，先加入少量水，充分混合(注意避免培养基结块)后再加水至所需的量。 3.溶解和分装 脱水培养基加水后适当加热，并不搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。 4.pH的测定和调整 用pH计测定pH，必要时在灭菌前调节pH，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，要求pH的变化不超过0.2pH单位。通常使用浓度约为40g/L( 约1 mol/ L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L)的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH，溶液需灭菌。 注:商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化，但使用蒸馏水或去离子水时，灭菌前无需调节pH。 5.分装 将配置好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积至少为体积的1.2倍。 6.灭菌 ① 概述 培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。 有些培养基无需高压灭菌，可煮灭菌。如，含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感，应在煮沸后快速冷却，避光保存。同样，一些试剂则不需要灭菌，直接使用(参见相关标准或生产厂商的使用说明）。 ② 湿热灭菌 湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培养基的体积超过1000mL，要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。 注：大容量培养基（＞1000mL）灭菌时可能会造成过度加热。加热后应采取适当的方式冷却，防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基（如含亮绿的培养基）是非常重要的。 ③ 过滤灭菌 过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和 0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌，或使用预消毒设备。 一些滤膜上附着蛋白质或其他物质(如抗生素)。为达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。 ④ 监测 应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。 7.添加剂的制备 制备含有有毒物质(特别是抗生素）时应小心操作，避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂；抗生素工作溶液现配现用；批量配置的抗生素溶液分装后向冷冻保存，但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料，也可由使用者自行测定。 二：培养基的使用 1.琼脂培养基的融化 将培养基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高压锅中的蒸汽)融化。经过高压灭菌的培养基尽量减少重新加热的时间，避免过度加热。培养基融化后立即移开，室温静置片刻(约2min），以免玻璃容器发生破裂。 融化后的培养基放入47℃~50℃ 恒温水浴锅?中保温，冷却到47℃~50℃所需的时间取决于培养基的类型、体积和在水锅里的分装量。融化后内培养基应尽快使用，放置时间一般不超过4h。剩余的培养基固后不得再次融化使用。特别是灵敏性培养基，应根据相关标准，缩短融化后放置的时间。 将琼脂培养基倒入类似检测培养使用的独立容器中，插入温度计，记录并保存琼脂的融化温度。 加入样品的培养基应将温度调节到44℃~47℃，或按照相关标准调节温度。 2.培养基的脱气 必要时，在使用前将养基放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器盖子；加热后盖紧盖子，并迅速冷却至使用温度。 3.添加成分的加入 对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃~50℃时加入，灭菌的添加成分加入前应冷却至室温，避免冷的液体会造成琼脂凝胶或形成片状物。将添加成分慢加入培养基并充分混匀，尽快分装到待用的容器中。 4.培养基的弃置 所有污染和未