拟南芥种植及处理基本方法.doc

______________________________________________________________________________________________________________ 精品资料 1 培养基 MS培养基（Sigma公司） B5培养基（pH 5.5） Content mg/L Content mg/L Content mg/L KNO3 2500 ZnSO4.7H2O 2.0 Nicotinic 1 CaCl2.2H2O 150 H3BO3 3.0 Thiamine HCl 10 MgSO4.7H2O 250 KI 0.75 Pyrindoxine 1 NaH2PO4.H2O 150 Na2MoO4.2H2O 0.25 m-Inositol 100 FeSO4.7H2O 27.8 CoCl2.6H2O 0.025 Glycine 200 MnSO4.H2O 10 Na2EDTA 37.3 Kinetin 0.1 CuSO4.5H2O 0.025 IAA 0.1-1 改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）： Content mM Content mM KNO3 1.25 ZnSO4 0.002 Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050 MgSO4 0.75 KCl 0.050 KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7O24 0.075 FeSO4 0.072 CuSO4 0.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO3 0.1 2 植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 oC，16/8 h的光照培养间中生长。 3 拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 °C下春化3-5 2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司） 处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4 植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上， 10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。 5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法 到网站 /tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB： LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。 方法： 将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。 DNA提取缓冲液的配制： 成分 终浓度 Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA-Na2 312.5 mM SLS （月桂酰肌氨酸钠） 1 % PVPP （polyvinylpolypyrollidone） 1 % 剪取一片叶于1.5 ml Eppendorf管中，液氮充分研磨。 加40 m 95℃ 12,000 rpm离心15分钟。 吸取上清于一新的Eppendorf管，取10 m PCR扩增体系为（25 ml体系）： 模板 1 ml rTaq 0.2 ml 10×rTaq buffer 2.5 ml dNTP(2.5 mM) 2 ml LP或LBa1(20 mM) 0.25 ml RP 0.25 ml ddH2O 18.8 ml PCR反应程序： 94° 3分钟 94° 1分钟 52° 1分钟 35个循环 72° 1分钟 72° 10分钟  Welcome To Download !!! 欢迎您的下载，资料仅供参考！