家禽用饲料品质检验—有毒有害成分的测定.pptx

项目三：家禽用饲料品质检验反相HPLC方法开发 方法建立的一般步骤了解基本情况明确分离目的选择分离模式前期准备检索文献方法具体试验短柱长、高流速、标准品、高强度洗脱液参照文献方法调节k’ 值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度 方法建立的一般步骤调节k’ 值改变保留值调节α值改变选择性改变流动相中有机相比例60/40 50/50 40/60通过改变流动相组成改变选择性 方法建立的一般步骤调节α值改变选择性通过改变固定相改变选择性C-18C-8 1、分析时要了解的情况想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法仪器制造商的文献掌握分离机理，自己开发方法充分了解自己的样品样品所含化合物的数目、种类（官能团）、分子量、pKa值、UV光谱图以及样品基体的性质（溶剂、填充物等）、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。 1、分析时要了解的情况灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂?是否已知样品所有成分的化学特性？有多少组分要分析? 是否有必要解析出样品的所有成分？对分析的精确度、准确度等有多高要求? 定量分析？定性分析？是否因是日常检验，而要求方法容易使用?本法将适用几种样品分析还是许多种样品分析？一次分析多少样品？ 2、确定样品的预处理方式可直接进样的溶液需稀释、pH缓冲、加入内标物或其它定容操作的溶液：多用流动相进行稀释定容需要首先溶解或提取处理的固体样品需预处理除去干扰物或消除“柱杀手” 3、分离模式的选择 4、具体试验的一般步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k’ 值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度记住∶ 每次改变一个参数 5、使用文献方法的注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 6、反相HPLC方案的设计步骤1、确定样品是属于常规的还是特殊的 特殊样品包括： 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 碳水化合物 异构体 6、反相HPLC方案的设计步骤2、选择分离条件，进行第一次分离分离变量最佳的初始选择柱填料C8 或 C18柱结构15*0.46 mm 或 25*0.46 mm，5μm流速1.5-2.0mL/min（注意柱压限制）流动相乙腈—水（中性样品）乙腈—缓冲液（离子型样品）（缓冲液为25-50mM磷酸缓冲液，pH2—3）对初始试验：5 → 100%B梯度温度常温进样量体积＜50μL（20 μL）；质量100μg 反相HPLC首次分离的建议实验条件 6、反相HPLC方案的设计选择流动相在反相色谱中常用水/乙腈pH的选择思路 ? 选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性 ? 低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小 ? 初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度 梯度尝试运行 6、反相HPLC方案的设计第一次HPLC运行 准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果第一次HPLC运行得到的结果可能是： 无峰/响应 分离度差的峰 检测方法不正确 浓度太稀提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品改变流动相优化系统得到了色谱峰 - 是 - 否检查 HPLC系统 6、反相HPLC方案的设计步骤3、做初次运行并根据谱图将样品分类等度洗脱可行的样品建议用梯度洗脱的样品反相保留太弱的样品改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱强保留样品用非水反相或正相条件复杂样品 6、反相HPLC方案的设计步骤4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B%步骤5、评价第二次运行中峰的质量--柱效、峰宽、峰形 ★ 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等） ★ 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间步骤6、 ★ 对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 ★ 若有必要，将ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH% ★ 可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化步骤7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 6、反相HPLC方案的设计步