DB50T 953-2019饲料中大肠杆菌0157的快速检测 环介导等温扩增（LAMP）法.docx

DB50/T 953—2019饲料中大肠杆菌 O157 DB50/T 953—2019 饲料中大肠杆菌 O157 的快速检测 环介导等温扩增(LAMP) 法 Rapid determination of Escherichia coli O157 in feeds ——Loop-mediated isothermal amplification detection method 2019-12-12 发布 B 46 重 庆 市 地 DB50 方 标 准 2020-03-15 2020-03-15 实施 重庆 市 市场监 督管理局 发 布 I DB50/T 953-2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由重庆市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心，重庆市兽药饲料检测所。 本标准主要起草人员：胡健、周莉、侯亚莉、朱英才、盛欣、丁平、何义刚、张毅、王美珍、张军 等。 1 DB50/T 953-2019 饲料中大肠杆菌 O157 的快速检测方法 环介导等温扩增(LAMP) 法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增(LAMP) 法检测饲料中大肠杆菌 O157 的原理、试剂、仪器和设 备、操作步骤、结果判定和表述。 本标准适用于饲料中大肠杆菌 O157 的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。 GB 4789.36 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌 O157 :H7/NM 检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 生物安全措施 培养物和废弃物处理应按照GB 19489的规定执行。 4 原理 用热裂解法提取大肠杆菌O157的基因组DNA作为环介导等温扩增模板，根据大肠杆菌O157的rfbE 基因特异序列，设计5条LAMP引物(参见附录A) ，建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据添加的 染料显色情况进行结果判断。 5 试剂 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯试剂，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 改良 EC 肉汤(mEC+n) 。 5.3 营养肉汤。 5.4 生理盐水。 5.5 双蒸水(ddH2O) 。 5.6 合成大肠杆菌 O157 检测用引物，包括外引物一对，内引物一对，环状下游引物一条。外引物 F3： 5’-TCTCAATTCTAACTAGGACCGCAGA-3’；外引物 B3：5’-ATAACTTGCTCATTCGATAGGCTGG-3’； 内引物 FIP ：5’-ACAGGGTAAAAAACTGGCCTGAGGAATTAAGGAATCACCTTGC-3’；内引物 BIP ： 5’-CACGATGCCAATGTACTCGGAAAAATAATTCCACGCCAACCAAGA-3’；环状下游引物 LB ： 5’-ATCAAAAGCACCCTATAGCTGAG-3。将各引物用双蒸水溶解，配置成 100 mmol/L 的储备浓度， 用双蒸水稀释为 10 mmol/L 工作浓度备用。 5.7 Bst DNA 聚合酶。 5.8 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPS) ，包括 dATP 、dTTP 、dGTP 、dCTP 各 10 mmol/L。 5.9 MgCl2 溶液(50 mmol/L) 。 5.10 10×Bst DNA 聚合酶缓冲液(200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、100 mmol/L KCl 、100 mmol/L (NH4)2 SO4 、20 mmol/L MgSO4 、1% Triton X- 100) 。 5.11 甜菜碱，用双蒸水溶解，配置成 5 mol/L 溶液。 2 DB50/T 953-2019 5.12 钙黄绿素 C46H46N2O23 ，用双蒸水溶解，配置成 625μmol/L 溶液。 5.13 MnCl2 ，用双蒸水溶解，配置成 7.5 mmol/L 溶液。 5.14 阳性对照：大肠杆菌 O157 标准菌株基因组 DNA。 6 仪器和设备 6.1 移液器，量程为 0.5 μL~10 μL ，10μL~100μL，量程 100 μL~1000 μL。 6.2 无菌均质袋，500mL。 6.3 锥形瓶，500mL。 6.4 水浴锅或恒温金属浴，精度±1℃。 6.5 高速离心机， ≥7000g。 6.6 恒温培养箱，精度±1℃。 6.7 电子天平：感量 0.01g、感量 0.0001g。