质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳课件.pptxVIP

质粒DNV的酶切鉴定 及琼脂糖凝胶电泳 1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并 理解限制性内切酶是DNA重组技术的 关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴 定DNA片段的有效方法。 2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双 链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。是体外剪切基因片段的重要工 具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中 重要的工具，而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定。 1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型 3) 核酸限制性内切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一 的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些 核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切 割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因 工程中用处不大，无法用于分析DNA结构 或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’ 垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序(palindrome)。 _和‘ 表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和 AATTC……3’ 、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各 有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯 键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’ |ATC …… 3’ 3’…… CTA’ |TAG …… 5’ 切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’ 。这种末端 同样可以通过DNA连接酶连接起来。 第三类( III型)限制性内切酶 也有专一 的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识 别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切 割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。 因此，这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此 不能应用于基因克隆。 3) 同裂酶和同尾酶： 同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺 序和切割位置都相同，其差别只在于当 识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种 限制性内切酶可以切割，另一种则不能。 例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 5’……G’CG_G……3’ ，如果其中有 5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切 割。这些有相同切点的酶称为同裂酶( 同切酶或异源同工酶) 。 同尾酶： 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾 酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接 起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时 可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1、 Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同， 但均给出相同的 “CTAG”粘性末端。这些 粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割， 但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点， 即 Bfa1的酶切位点。 4) 限制性核酸内切酶的命名法 v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco 表 示，所以用斜体字。 v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。 v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后 能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其 密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下 及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就 可以向阳极迁移。 影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素： DNA分 子的大小、 DNA的构象、电压、电场方向、 碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。 琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状 DNA的迁移率，因此采用不同浓度的 凝胶可以分离不同大小范围的DNA片 段。 0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨 1-25kb的片段； 0.5% 的琼脂糖凝胶用 于分辨较大片段的DNA (20-100k