nrf2过表达对hsc-6激活与增殖及i型胶原mrna及蛋白表达水平的影响.docxVIP

nrf2过表达对hsc-6激活与增殖及i型胶原mrna及蛋白表达水平的影响 氧气激活是肝星状细胞（hss）的中心环节，包括肝功能激活（hcss）。过度摄入的乙醇及其代谢产物是引起肝脏内氧化应激的主要介质, 当肝内处于持续氧化应激的环境时, 肝星状细胞被激活, 表型向肌成纤维样细胞 (myofibroblast-like cells) 转化, 分泌大量细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 导致肝内基质沉积, 最终引起肝纤维化乃至肝硬化。核因子E2相关因子2 (nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) 作为调节抗氧化应激反应的重要转录因子, 可增强细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性。而Nrf2对乙醇诱导下HSCs活化水平的影响, 目前国内外尚未见报道。为此, 本研究应用体外细胞培养技术, 以乙醇刺激HSCs增殖活化, 在脂质体介导下瞬时转染Nrf2重组质粒, 探讨Nrf2对乙醇诱导下HSCs增殖水平、细胞周期分布及活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA) 、I型胶原 (collagen type I, ColⅠ) m RNA和蛋白表达水平的影响。 材料和方法 1 转染、免疫和总蛋白 大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自湘雅细胞库, 系SV40转染SD大鼠HSCs而成, 具有活化HSCs的表型。p EGFP-Nrf2重组质粒及空载质粒p EGFP-N1合成于Invitrogen (项目编号:KL120712001) 。转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen。培养基DMEM购自Hy Clone。胰蛋白酶和胎牛血清购自Solarbio。TRIzol RNA提取试剂盒和DMSO购自北京全式金生物技术公司。逆转录试剂盒购自Ta Ka Ra。各目的基因引物由上海生工生物工程公司合成。2×Taq PCR Super Mix购自北京全式金生物技术公司。总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体、兔抗Col I多克隆抗体和鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体购自Proteintech。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司。FACSCalibar流式细胞仪为Beckton Dickinson产品。 2 方法 2.1 细胞复苏后培养与分组 HSC-T6复苏后采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的高糖DMEM培养, 置于5%CO2、37℃孵箱培养。细胞复苏培养至80%~90%融合度左右进行传代。将浓度为1×108cells/L HSC-T6细胞悬液接种于6孔培养板中, 每孔2 m L, 37℃、5%CO2孵箱培养24 h后随机分为4组: (1) 正常对照组; (2) 乙醇刺激组; (3) 乙醇刺激+p EGFP-Nrf2质粒组; (4) 乙醇刺激+p EGFP-N1空质粒组。 (2) ~ (4) 组中乙醇终浓度均为100 mmol/L, 每组设3复孔。 2.2 转染介质的制备 转染前24 h在不含抗生素的培养基中接种适量细胞使转染时细胞的汇合度达到50%左右。以LipofectamineTM2000作为转染介质, 参考LipofectamineTM2000试剂盒说明书, 混合转染试剂及质粒再按组加入继续培养4~6 h后弃培养基, 更换新鲜无双抗培养基继续培养至48h后收集细胞。 2.3 pcr扩增条件及检测 HSC-T6分组处理完成收集细胞后, 采用TRIzol试剂进行细胞总RNA提取, 紫外分光光度计检测浓度。逆转录为c DNA, 以此为模板进行PCR扩增。目的基因引物序列见表1。参照Two-Step RT-PCR试剂盒操作说明书进行RT-PCR, 总反应体积50.0μL, 其中2×Trans TaqTMHi Fi PCR Super MixⅡ25.0μL, dd H2O21.0μL, 上游引物1μL (10.0μmol/L) , 下游引物1μL (10.0μmol/L) , c DNA 2μL。扩增条件:Nrf2:94℃5 min;94℃35 s, 60℃35 s, 72℃35 s, 35个循环;72℃7 min。α-SMA:94℃5 min;94℃35 s, 63℃35 s, 72℃35 s, 35个循环;72℃7 min。Col I:94℃5 min;94℃35 s, 62℃35 s, 72℃35 s, 35个循环;72℃7 min。β-actin:94℃5 min;94℃35 s, 60℃35 s, 72℃35 s, 35个循环;72℃7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后, 用