东北鹤虱提取物legps-抗小鼠巨噬细胞氧化损伤的作用研究.docxVIP

东北鹤虱提取物legps-抗小鼠巨噬细胞氧化损伤的作用研究 拉托戈科动物（leg）是紫草科植物的一种树干，分布在中国北方和东北地区。药书记载,其味苦、辛、平,入脾、胃、肝三经,可治疗虫积腹痛,民间用其果实或全草水煎治疗各种腹疼、腹泻,尤其对慢性、迁延性腹泻有独到的疗效。前期研究证明其提取物LEGPS-Ⅱ对淋巴细胞及巨噬细胞功能有增强或调节作用,本文旨在研究该提取物对小鼠巨噬细胞氧化损伤是否有保护作用,进一步探讨其可能的作用机制。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 legps- LEG产地为我国黑龙江省,种子类药材,呈卵形,长约3～3.5 mm,由黑龙江中医药大学药学院药用植物学教研室于加宾教授鉴定。取干燥的LEG,粉碎至20目,水煎煮,过滤除药渣后合并药液,以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋白,得到粉末状淡黄色提取物LEG-I。LEG-I经阴离子交换柱层析再浓缩透析冻干得东北鹤虱提取物(LEGPS-Ⅱ),淡黄色粉末,易溶于水,纯度为38.7%。药物用PBS缓冲液配制成1 mg/m L储备液,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,-20℃冰箱保存,临用前用PBS缓冲液稀释成所需浓度。 RPMI-1640培养液,北京天润善达生物科技有限公司;超级新生牛血清,美国Gibco公司;四甲基偶氮唑盐(Methyl thiazolyl tetrazole,MTT),瑞士Fluka公司;二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),美国Amresco公司;一氧化氮(NO)测试盒(硝酸还原酶法),南京建成生物研究所,批分型一氧化氮合成酶(NOS)测试盒,南京建成生物研究所,批BCA蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术研究所;总超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,南京建成生物工程研究所,批微量丙二醛(MDA)试剂盒,南京建成生物工程研究所,批 1.1.2 实验动物及其密度 近交系清洁级昆明种小鼠,体质量均为(20±0.25)g,4～6周龄,雌雄不拘,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(批准文号:SCXK-2010-003),实验前置动物于室内适应环境1周,不限食水,室温18～22℃,相对湿度50%～70%。 1.1.3 生物本构物的表征 SW-CJ-1F型超净工作台(苏州净化设备有限公司);Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱(Thermo Electron Corporation);CK40生物倒置显微镜(Olympus);Model 680型酶标仪(Bio-Rad);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BFX5-320型低速自动平衡离心机(白洋离心机厂)。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞活力检测 昆明种小鼠1只,颈椎脱臼处死,完全浸入75%酒精内消毒5 min后取出,移入超净台内固定其四肢。小鼠腹腔内注入冷PBS缓冲液5 mL,轻揉腹部5 min后,用眼科剪小心剪开腹部皮肤,暴露腹膜。于腹膜上剪一小口,用无菌吸管深入腹腔内吸回PBS液。将吸出液离心1 500 r/min 10 min后弃上清,用含10%超级新生牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬沉淀。台盼蓝测定细胞存活率为90%以上,计数,用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL。无菌条件下收集正常小鼠腹腔MΦ悬液完毕。 1.2.2 legps-保护组与外加剂2. RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL接种于96孔板,将培养的细胞分为5组:正常对照组:加入等量培养液,不加任何药物;H2O2损伤组:加入终浓度0.2 mmol/L的H2O2作用0.5 h;LEGPS-Ⅱ(30,60,120μg/mL)保护组:分别加入不同浓度的LEGPS-Ⅱ孵育3 h后加入0.2 mmol/L的H2O2,继续孵育0.5 h。每个浓度组设重复孔6个,37℃二氧化碳培养箱培养,后弃原培养基,各孔加入含MTT 20μL(终浓度0.5 mg/L)的培养基继续培养4 h,吸弃孔内培养液,每孔加入100μL DMSO,震荡5 min,用酶标仪于570 nm波长处测定吸光度值,以OD测定组/OD对照组×100%计算细胞存活率。 1.2.3 no、t-sod和mda的测量 实验分组同上,指标测定按南京建成生物工程研究所试剂盒方法操作。 1.2.4 细胞破碎与活性 将巨噬细胞接种于6孔板中,实验分组同上,用细胞刮将细胞刮下,将培养液在室温条件下1 000 r/min离心10 min,弃上清留细胞沉淀。在细胞沉淀中加入0.5～1 mL的生理盐水(等渗),轻轻颠倒混匀,将培养液在室温条件下1 000 r/min离心10 min,弃上清留细胞沉淀。重复这一操作1～2次。超声