一株铜绿微囊藻中溶藻细菌的分离鉴定及溶藻效果研究.docxVIP

一株铜绿微囊藻中溶藻细菌的分离鉴定及溶藻效果研究 现在，由藻类引起的洪水和赤潮在世界范围内频繁爆发。中国三大富营养湖泊（太湖、云南和湖泊）经常爆发铜绿微囊藻类水华，导致严重的社会、经济和环境问题。为了减少和控制藻类的爆发，使用了物理和化学方法，但它们带来的经济问题和二次污染问题不容忽视。近年来，生物方法的使用被认为是控制洪水和赤潮的最重要生物之一。细菌、放线菌、真菌、原生动物和病毒在控制洪水和赤潮方面显示出了较高的应用前景。特别是，溶菌性细菌被认为是控制水和赤潮的最重要生物之一。罗夏pb等人根据溶解方法对55株普通绿藻细菌中的36株进行了分类，其中30%是直接溶藻，70%是间接溶藻。间接藻主要用于分泌细胞外物质。 目前,国内关于溶藻细菌的的文献报道较多,但更多集中在菌株的分离鉴定与溶藻效果上[6~9],对菌株在溶藻过程中细胞数目的动态变化研究较少.同时对于以释放物质进行间接溶藻的菌株,其发酵液具有溶藻效果,菌体却无溶藻效果没有进行合理地解释[9~11],从而限制了对溶藻细菌进一步的研究和应用. 本文从太湖爆发铜绿微囊藻水华时期分离出一株具有溶藻作用的菌株CA,首先排除了菌藻共培养过程中细菌液体培养基对铜绿微囊藻生长的抑制作用,通过洗脱平板上CA的菌落得到CA的菌悬液,研究了CA菌悬液的溶藻效果、溶藻方式以及添加外源物质对菌体溶藻效果的影响. 1 材料和方法 1.1 生物样品的制备 实验藻种为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-469),购买于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心.藻种经活化接种于BG11培养基,置于恒温光照生化培养箱中静置培养,温度(28±0.5)℃,光照强度72μE m-2s-1,光暗周期比14 h:10 h.通过藻液颜颜色观察、显微镜观察和叶绿素a含量测定检测藻种的生长状况. 1.2 培养基的制备 牛肉膏蛋白胨(简称NA)液体培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,水1 L,pH 7.0~7.2.牛肉膏蛋白胨(简称NA)固体培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,Na Cl 5 g,琼脂20 g,水1 L,pH 7.0~7.2.1/10牛肉膏蛋白胨培养基(简称1/10NA):牛肉膏0.3 g,蛋白胨1 g,Na Cl 0.5 g,水1 L,pH7.0~7.2.改良基础柠檬酸钠(简称MBCS)培养基:NH4H2PO41 g,K2HPO41 g,Na3CA 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,蒸馏水1L,pH 7.0~7.2.2216E细菌培养基:陈海水1 L,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,磷酸高铁0.1 g,pH 7.6.LB培养基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,水1 L,pH 7.0~7.2.淀粉(简称ST)培养基:溶性淀粉10 g,K2HPO41 g,NaCl 1 g,MgSO4·7H2O1 g,(NH4)2SO42 g,蒸馏水1 L,pH 7.0~7.2.改良的查氏(简称MC)培养基:蔗糖10 g,NaNO32 g,K2HPO41 g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H20 0.01 g,蒸馏水1 L,pH 7.0~7.2.无机盐(简称IS)培养基:NH4H2PO41 g,Mg SO4·7H2O0.2 g,NaCl 5 g,K2HPO4 1 g,葡萄糖5 g,蒸馏水1 L pH 7.0~7.2. 1.3 分离菌种的制备 筛选溶藻细菌的样品取自太湖水华消退期的表层水样、底泥、表层沉积物和腐烂的藻体.分离和筛选采用菌藻共培养法.将底泥、表层沉积物和腐烂的藻体用生理盐水重悬,按照1:10的比例接入生长良好的铜绿微囊藻藻液中,水样直接按照1:10的比例加入铜绿微囊藻藻液中,以不接种任何样品的铜绿微囊藻藻液为对照.一周后,将黄化的藻液过0.8μm滤膜,按照1:10的比例重新接入新鲜的藻液中.将再次黄化的藻液重新接入新鲜的藻液中,如此重复两次后,将仍发生黄化的藻液用无菌水稀释,在NA培养基平板上涂布,挑选单菌落.单菌落纯化后接种于液体NA培养基,将其发酵液按照1:10的比例接入D680 nm=0.5的正常生长的藻液中,对照添加等量无菌的NA培养基.培养3 d后与对照比较,能够使铜绿微囊藻藻液明显黄化现象的菌株即为溶藻菌株将分离的菌株于-70℃中保存(含15%的甘油). 1.4 srrna扩增、纯化及测序 使用东盛公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取CA菌株的基因组DNA,选用细菌16S r DNA扩增通用引物27f/1492r.正向引物27f:5’-AGAGTTT2GATCCTGGCTCAG-3’反向引物1492r:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’,扩增反应体系为:10×Taq聚合酶反应缓冲液