56肾切除大鼠模型肾功能改变及肾组织-平滑肌肌动蛋白表达的变化.docxVIP

56肾切除大鼠模型肾功能改变及肾组织-平滑肌肌动蛋白表达的变化 慢性肾衰竭（rcg）是各种肾疾病继续发展的最终结局，严重威胁着患者的生命。其主要病理特征是慢性肾间质纤维。建立一种既可以反映肾功能进行性恶化, 又有间质纤维化改变的动物模型, 对于研究间质纤维化发生发展机制及其在CRF中的地位, 探寻各种延缓和阻断CRF进展的新方法具有十分重要的意义。本研究采用5/6肾切除 (5/6 nephrectomy, 5/6NT) 的方法建立伴有慢性肾功能衰竭的肾间质纤维化动物模型。 1 材料和方法 1.1 动物中心提供20d 90只清洁级雄性Wistar大鼠 (本校实验动物中心提供) , 6~8周龄, 体重200±20 g。按1∶2比例随机分为2组, 假手术组 (SOR) 30只和5/6NT组60只。 1.2 动物肾损害处理 采用二期法:速眠新Ⅱ号1 ml/kg大腿肌肉注射麻醉大鼠, 选取背左侧切口, 暴露左肾, 剥离肾包膜, 将肾的上下级各1/3切除, 明胶海绵压迫切面止血。1期手术后7天, 行2期手术, 同样方法麻醉, 右侧背部切开暴露右肾, 结扎肾蒂, 摘除右肾。假手术组与5/6NT组动物同期进行二次手术, 但仅剥离肾包膜暴露肾脏后关腹。5/6NT组于二期手术后30、60、90天, 每组随机选取15、15、18只大鼠处死。处死前一天将大鼠置于代谢笼中 (禁食, 不禁水) , 收集24 h尿液测尿量, 大鼠24 h尿经离心 (2000 r/min, 10 min) , 去除沉渣。麻醉下心脏采血, 血液收集后经离心分离出血清, 尿液和血清均保存于-20℃冰箱。取左肾组织称重, 用4%多聚甲醛固定, 石蜡包埋。 1.3 检测方法 1.3.1 血液和尿液生化指标的测定 全自动生化分析仪 (Olympus AU5400) 检测24小时尿蛋白、血清肌酐及尿素氮。 1.3.2 小鼠肝肾组织病理学检查 肾组织经4%多聚甲醛固定、包埋, 切成3 μm厚石蜡切片, 做苏木素-伊红 (HE) 染色。测定肾小球面积 (GA) 、肾小球毛细血管袢体积 (GV) , 对肾小球硬化、小管间质损伤程度进行评分, 计数间质浸润的炎细胞。 (1) 400倍光镜下, 每张切片随机选择15个肾小球, 采用全自动图像分析系统 (Image-pro plus 4.5) 进行肾小球面积 (GA) 测定, 根据文献, 计算肾小球毛细血管袢体积 (GV) , GV =β/k× (GA)3/2, 其中β=1.38 (形态系数) , k=1.1 (大小分布系数) 。 (2) 肾小球硬化程度评分 肾小球硬化定义为毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变。采用Raij等的半定量法。200倍光镜下, 每张切片至少观察30个完整肾小球。根据硬化灶所占肾小球比例分0~3级:0级, 肾小球无病变或病变面积25%;1级, 病变面积25%~50%;2级, 病变面积51%~75%;3级, 病变面积≥76%。计算肾小球硬化指数 (glomerulosclerosis index, GSI) , GSI=[ (1×n1+2×n2+3×n3) /每片肾小球总数]×100% (n1为评分1级的肾小球个数, n2为评分2级的肾小球个数, n3为3级的肾小球个数)。 (3) 肾小管间质损伤评分 按文献描述的方法, 半定量肾小管间质的病变。200倍光镜下, 每张切片随机选择10个不含肾小球的视野。肾小管间质病变包括肾小管萎缩、间质炎细胞浸润及间质纤维化3个参数。每个参数按0~3分评定 (0=正常, 1=轻度受损, 2=中度受损, 3=重度受损) 。每个样本小管间质的评分为0~9分。 1.3.3 染色区和染色强度分级 按试剂盒说明进行免疫组织化学染色。采用Floege半定量法进行评定。按染色区和染色强度分为0~4级:0级, 无染色或染色极弱;1级, 局部弱染色, 染色区25%;2级, 染色区25%~49%;3级, 染色区50%~75%;4级, 染色区75%。 1.4 数据处理方法 数据资料用ˉx±sxˉ±s表示, 采用SPSS11.5统计软件处理。组间差异采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 。组间两两比较用q检验法。P0.05有统计学意义。各指标之间的关系判断用Pearson单因素相关分析。 2 结果 2.1 生态变化 5/6NT组术后30、60、90天24小时尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐水平较SOR组明显增高 (P0.05) 。 2.2 手术切口前裂缝 5/6肾切除术后残肾体积逐渐增大, 被网膜包裹难以剥离。手术切口瘢痕处内陷, 其余部分外凸, 形状不规则。残肾的肾重/体重逐渐增加, 到术后90天时, 几乎接近SOR组大鼠左肾。 2.3 小鼠肝肾硬性病 假手术组肾小球、肾小管结构正常, 无炎性细胞浸润。5/6