分子生物学-研究方法(上).pptx

第五章 分子生物学研究方法（上）; 本章主要内容 常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术;引言;从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。; 基因工程的主要内容或步骤 “分---切---连---转---筛” （1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。;基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。;重组DNA实验中常见的主要工具酶;1 DNA操作技术?;1.1 核酸的凝胶电泳; 琼脂糖凝胶电泳; 聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶类型及浓度 ;1.2 转基因方法 1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction） 1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法 1.2.3 植物转基因的方法 (1)Ti质粒介导 (2)电转化法 (3)基因枪法;1.3.1 放射性同位素技术 同位素：原子序数相同而质量不同的元素。 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α-射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用的是放射性同位素。; 放射性的衰变类型 α-射线：带正电荷的高速粒子流 β-射线：带负电荷的粒子流 γ-射线：光子流 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质 元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年; 放射性强度的探测 （1）盖革计数器（Geiger counter tuber），闪烁计数器。 （2??放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在黑暗中，-70℃，曝光。 放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应，生化分离技术; 核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针;1.3.2 分子杂交类型;1.3.3 核酸分子杂交; ;1)电泳:将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。 2)转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。 3)杂交:将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交。;放射自显影; 某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2泳道呈较长的弥散形杂交带；第3泳道有3条较清晰的杂交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分析上述实验结果。; Southern杂交应用举例;;检测重组体克隆的菌落杂交技术;（4）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）： 指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，以确定探针互补序列在胞内的空间位置。;1.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR） PCR技术简史 1.4.1 PCR原理 PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技术。待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温（如52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原DNA片段就可得到大量扩增。;1.4.2 PCR反应体系 Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10× Buffer 1.4.3 基本反应步骤;① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便与引物结合。;Primer 1;Primer 1; 一般每完成一个循环需2-