第四章柠檬酸发酵微生物及发酵机理详解演示文稿.pptVIP

（一）斜面低温保藏法 此法是生产中最普遍采用的一种保藏方法。 操作步骤： 菌种孢子移接于麦芽汁琼脂斜面后，于35℃下培养7～8天，待长满黑褐色孢子后，放在2～4℃冰箱中保藏，此法可保藏1～2个月。 优点：简便易行，容易推广，存活率高。 缺点：菌株仍具有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种容易发生变异和被污染。 本文档共105页；当前第63页；编辑于星期三\15点6分 （二）载体吸附保藏法 载体吸附保藏的原理是将菌种吸附固定在适当的载体上，进行干燥保藏，通常使用的载体有砂土、麸皮、谷粒或麦粒、硅胶、粒状活性炭、滤纸等。这些载体对菌种起着一定的保护作用。 例：砂土管保藏法 （1）砂土制备 不含腐殖质土壤 浸泡洗涤数次至中性 烘干碾碎 筛去粗粒 清水 筛孔为 0.18mmｘ0.18mm 本文档共105页；当前第64页；编辑于星期三\15点6分 河砂 煮沸30min 倒掉酸水 冲洗至中性 烘干 筛去粗粒 （2）无菌砂土管制备 砂与土2:3混合 小试管 灭菌30min 冷却 保温过夜培养 再次灭菌 （3）1mL孢子悬浮液 砂土管 接种针搅匀 包扎 干燥器 真空干燥8h 盛有P2O5的干燥器 2～4℃冰箱 10%稀盐酸 清水 40目或60目筛 0.15MPa蒸汽压力 本文档共105页；当前第65页；编辑于星期三\15点6分 （三）真空冷冻干燥保藏法 又称冻干法，它通常是用保护剂制备拟保藏柠檬酸产生菌的孢子悬浮液于安瓿（bu）管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水分升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌快。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保存。 在冷冻过程中，添加保护剂，是为避免孢子在冻结和干燥过程中死亡。黑曲霉孢子的保护剂一般采用牛、马、羊血清或者用脱脂牛奶加1%谷氨酸钠。 本文档共105页；当前第66页；编辑于星期三\15点6分 优点：利用有利于菌种保藏的一切因素，使黑曲霉柠檬酸产生菌的孢子始终处于低温、干燥、缺氧的条件下。保存期可达1年至10年之久。 缺点：操作比较繁琐，技术要求较高，而且需要冻干机等设备。 本文档共105页；当前第67页；编辑于星期三\15点6分 （四）液氮超低温（-196℃）保藏法 该方法以甘油或二甲基亚砜为黑曲霉的保护剂，在液氮超低温（ -196℃）下保藏的方法。 -196℃远远低于微生物新陈代谢作用停止的温度（-131 ℃），此时菌种的代谢活动已经停止，化学作用也随之消失。 其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 本文档共105页；当前第68页；编辑于星期三\15点6分 美国ATCC菌种保藏中心采用该方法作为常规保存方法，以1 ℃/min的制冷速度将菌液从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196 ℃液氮冷箱中。 如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。 此法操作简便、高效、保藏期可达15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏方法。 本文档共105页；当前第69页；编辑于星期三\15点6分 第四节 黑曲霉柠檬酸生产菌的纯化与复壮 柠檬酸生产菌种，在生产使用或保存的过程中可能因为稍有不慎，菌种被污染；因环境条件变化和自发突变，日积月累引起菌种生产性能的急剧衰退，造成生产不正常。 菌种退化，是一种可遗传的变异，由于基因突变、连续传代和采用不适宜的培养和保藏条件等引起的，使某种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 本文档共105页；当前第70页；编辑于星期三\15点6分 柠檬酸菌种退化的病症主要有： (1)菌种在扩大培养时，生长微弱或过度旺盛，产孢子能力下降或丧失； (2)发酵培养基和操作条件确信无异常情况下，产酸能力普遍下降； (3)发酵液粘度升高，菌丝球形态、大小发生变化； (4)平板分离检查无杂菌，但菌落大小有差别或异常，甚至产孢子能力、孢子的颜色等也发生变化。 本文档共105