质粒的转化及转染.docVIP

质粒的转化 转化（transformation）是某一 基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间 遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种； 转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在 基因工程中是将 质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。 质粒转化的目的：将质粒转入细菌内以便获得更多的质粒，达到扩增的目的。 质粒转化操作步骤：（热激法） 1、从－80℃冰箱中取出感受态的细菌在冰上融化。（感受态下的细菌更容易接受外源性的DNA） 2、打开大实验室（千万不可拿进细胞房，天敌）的细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min。 3、打开水浴锅加热，温度设置为42℃。 4、取若干EP管，标记后，每EP管中加入50μL的菌液。如質粒難抽，則加大用量。 5、每EP管加入2.5μL的质粒后打匀，动作要轻柔，感受态细菌比较脆弱。 6、将EP管放在冰上孵育25min。 7、将EP管插入浮萍放入42℃水浴锅加热60s（要求时间绝对精确）。 8、将EP管插入冰块90s。 9、每EP管加入1ml细菌培养基后放入大摇床上摇45min（大摇床带有加热功能，温度为37℃）。 10、将Amp细菌培养板（培养基预先加入Amp）放入细菌培养箱中加热至37℃。 11、将枪头预先折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上。（每盘100μ） 12、待液体稍干后将细菌培养板倒置放入细菌培养箱中12—16h。（过夜） （倒置的目的是为了液体影响细菌生长，另外液体影响观察单克隆体） Amp青霉素（氨苄青霉素Ampicillin）： 目的并不是为了灭菌，Amp本身就是抗生素，而是用它来筛菌。 是一种抗生素。为广谱半合成青霉素，毒性极低。抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。对革兰阴性菌有效，但易产生耐药性。 Kana 挑单克隆操作步骤：（小摇） 1、准备小摇管（一般用15ml离心管）：做好标记后每管加入： 3ml细菌培养基 + 3μLAmp （1:1000比例，目的是为了杀死假阳性的克隆细菌） 2、在细菌培养板上用小枪头挑单个菌落入小摇管。（为了使得手不抖动，最好将手紧贴操作台的玻璃面；一旦发觉枪头沾有多个菌落，要立刻弃之不用） 3、用封口胶松松地封好瓶口放入大摇床，37℃摇12-16h。（瓶盖不要拧紧，保证瓶内与瓶外的空气相流通，使得细菌能够有充足O2的供应） LB Broth Medium培养基：由酵母菌、胰蛋白酶、NaCl组成。（很香） 注意事项1：15ml离心管里只加入3ml的细菌培养及的原因是使得细菌能够与更多的空气相接触。 注意事项2：放入摇床摇的目的是为了使得细菌充分接触O2，帮助它们良好生长。 注意事项3：细菌培养先小摇后大摇的原因，。 细菌生长曲线 细菌培养板制备操作步骤：（Amp） 1、每培养盘——20ml去离子水 + 0.8g LB Broth Agar(soe) 一般配10盘 200ml去离子水 + 8g LB Broth Agar(soe) 2、配好后的培养基放入高压灭菌锅灭菌。 3、待烧瓶温度降到人体适宜温度之后，加入200μLAmp（1:1000比例；要在培养基凝固前加入混匀） 4、找出细菌培养板，正反面皆做好标记（防止盖子拿错，因为后来细菌生长时需倒置，只标记一边容易混淆），抗性+制备者+日期（一般1个月内有效）。 5、每培养板加入20ml的已加入Amp的培养基，等待约30min使之凝固。（不能有气泡，用长枪加） 6、用封口胶封好细菌培养板放入细菌培养箱，过夜（12-16h）看是否长细菌。如果不长则可以使用。 方法2，现在培养皿里加入Amp，然后再加入，如此如果后来凝固的话，可以放到微波炉里加热 高压灭菌锅的使用注意事项： 1、看锅内和锅外蒸汽收集壶的水位：锅内的去离子水要没过下面的八角形金属板，锅外的蒸汽收集壶的水位要介于High和Low之间。 2、开启高压灭菌锅灭菌后，要等到温度低于60℃方可开启。 步骤：（大摇） 1、用三角瓶制备细菌培养基： 200ml去离子水 + 5g LB Broth Medium培养基（1:40重量比例）。 2、用锡箔封好瓶口，放入高压灭菌锅灭菌（一般时长2h，锡箔一定要尽量压严密，防止细菌进入）。 3、标记灭菌后的三角瓶，每瓶在其内加入200μLAmp。 4、从小摇管内吸取1ml菌液进入大摇瓶（三角瓶），打匀 放入大摇箱，12-16h