PCR技术及应用完整版.ppt

出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因： 一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。 二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有： ①必要时重新设计引物。 ②减低酶量或调换另一来源的酶。 ③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(94℃变性，65℃左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有： ①减少酶量，或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓度。 ④增加模板量，减少循环次数。 PCR技术的发展 反转录PCR (RT-PCR) mRNA cDNA PCR Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶 注意问题： 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度 用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达 第一步：mRNA在反转录酶和引物合成cDNA第一链； 第二步：加热cDNA第一链与RNA链解离，与另一引物退火，DNA聚合酶作用下合成cDNA双链，然后扩增。 RT-PCR对RNA样品要求极严。 用途：基因表达研究（定量PCR）和病毒检测。 定量PCR (Q-PCR；real time PCR or RT-PCR) 荧光标记的探针通过检测荧光的强度来对扩增的模板进行定量的PCR方法。 分为DNA-PCR和RNA-PCR定量。 反向PCR (Inverse PCR) 已知序列 PCR 用途：未知序列的研究 扩增一段已知序列两侧的DNA 反应不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA 降落PCR (touch-down PCR) 多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的退火温度选择为高于Tm值，随着循环进行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最终低于这个水平。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度。 原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 热启动PCR (hot start PCR) 热启动PCR是除了设计好的引物之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 尽管Taq脱氧核糖核酸聚合酶的最佳延伸温度在72℃，但聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 进行反应之前，将Taq酶先不加，等温度上升到70 ℃后再加入。 Platinum DNA聚合酶用于自动热启动PCR。常温活性被封闭，94—95 ℃加热几分钟后才恢复酶活性。 嵌套PCR (nested primer PCR) 采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内 P1上 P1下 P2上 P2下 用途：① 验证第一次PCR产物的特异性 ② 进行特殊PCR，如合成探针模板 先用第一套引物（外引物）扩增15-30个循环，再 用第二套引物扩增15-30个循环。 第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的模板材 料。 增加反应敏感性，获得高度特异性靶序列。 热不对称交错PCR 技术 Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL) PCR Unknown seq Unknown seq known seq SP1 AD SP2 SP3 Plasmid rescue Inverse PCR …… 获得侧翼序列的方法 TAIL-PCR TAIL-PCR 实验流程 不对称PCR (Asymmetric PCR) 用不等量的一对引物产生大量单链ssDNA。 两个引物分称为限制引物和非限制引物，比例一般为50-100：1。 也可用常规PCR获得目的基因的双链DNA，再以其为模板，用其中一种过量的引物进行第二次单引物PCR，以制备ssDNA。 产生的ds-DNA与ss-DNA通过电泳分开，获得纯ssDNA 。 制备单链探针。 原位PCR (in situ PCR) 在组织细胞里进行PCR反应，结合原位杂交和PCR技术的优点，基本步骤如下：　　 ① 固定组