分子克隆技术(讲稿).ppt

图4-6 pUC质粒物理图谱 pUC18、pUC19质粒载体 * pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。 pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。 pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（lacZ?基因），该基因编码?-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型?-半乳糖苷酶实现基因内互补（?-互补），形成完整的?-半乳糖苷酶 * 第二节 载体一、克隆载体 （二）噬菌体载体 （三）粘性质粒(cosmid) （四）酵母人工染色体 （五）动物细胞基因克隆的载体 猿猴空泡病毒40（SV40）载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体 * 外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要 。 真核基因在原核细胞中表达需要有效转录及一系列调控元件，必须保证外源基因－－插入方向的正确性；受原核启动子的控制；必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。 基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。 第二节 载体二、表达载体 表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体，带有表达所需的各种元件。 * （一）原核细胞表达载体 原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号。 第二节 载体二、表达载体 * 第二节 载体二、表达载体 5?—TTGACA——TATAAT———//——3? -35区 -10区 转录起始点 Pribnow box DNA 如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和PR启动子等。 原核细胞启动子示意图 （一）原核细胞表达载体 1. 启动子（promoter）： * （一）原核细胞表达载体 2. SD序列 第二节 载体二、表达载体 mRNA * （一）原核细胞表达载体 终止子：一个基因的3?末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。 该序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有茎环状局部二级结构。 第二节 载体二、表达载体 * （二）哺乳动物细胞表达载体 真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子—克隆位点—终止位点和加poly A信号。 1．原核DNA序列 包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。 2．启动子 转录起始位点上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游约100~200bp处为上游启动子元件。 3．增强子（enhancer） 是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。 4．终止子和加polyA信号。 第二节 载体二、表达载体 * 第二节 载体三、穿梭载体 穿梭载体（shuttle vector）：人工构建的既带有原核细胞的复制元件、又带有真核细胞的复制元件，既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，能够在两类不同宿主中复制、扩增和选择的载体。 * 目的基因的制备 载体的选择和制备 目的基因和载体连接 重组DNA导入受体细胞 目的基因的筛选和鉴定 第三节 分子克隆的基本步骤 * * 调控元件（如强启动子及两侧的调控序列、目的基因表达的正确阅读框架、终止子等） * ?噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库，构建cDNA文库和克隆较小DNA片段常用pUC系列等质粒，M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。 * 质粒的分子量一般为106~108 ，小型质粒的长度一般为1.5~15Kb。 遗传标志，如：抗生素的抗性基因，?-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。 分子克隆技术Molecular Cloning 分子生物学技术 基因工程（gene engineering ）：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作。 分子克隆（molecular cloning ）:将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。 * 主要内容 第一节