高效液相色谱仪-课件.pptxVIP

高 效 液 相 色 谱;一、高效液相色谱仪;Waters 2487;借助气相色谱的理论演变;5;三、流程及主要部件;2. 主要部件;高压泵作用：输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵送入色 谱柱。由于色谱柱的阻力很大，高压泵必须克服阻力以恒定流速输送流动相，这是保证色谱仪精确度的前提。 常用的压力范围：150～350×105 Pa 欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。定义为英镑/平方英寸， 它们之间的换算关系为： 1bar≈14.5psi =105Pa ， 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar;高压泵应具有以下性能 流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修;根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵 气动放大泵（恒压泵） 往复泵（恒流泵）是目前液相色谱使用最普遍的一种高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小，容易洗净，故更换溶剂十分方便，尤其适合做色谱条件试验时使用。;(2) 进样装置;图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。;样品环(Loop);自动进样器;色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中，保持色谱柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。;色谱柱（Column）;C18柱（C8柱）;C18柱（C8柱）性能影响因素;正相柱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团，如胺基(NH2)和 氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。 反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的 键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。;;(4) 液相色谱检测器;双波长紫外检测器 2487 工作原理：基于朗伯-比尔定律。 即用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。 它具有波长固定，波长可变和光电二极管阵列三种类型。;特点：选择性检测器， 灵敏度较高（10-9g），噪音低。;溶 剂;原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器； 对温度变化比较敏感，要保持在±0.001℃ （需配柱温箱使用） ； 灵敏度低(10-6g)； 不能用于梯度洗脱。;原理: 利用某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性质进行检测。 许多药物和生命活性物质(多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等)具有天然荧光，能直接检测。;特点: 选择性检测器，;工作原理:通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气(氮气)喷成 雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。;适用范围：适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂， 维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。 特点：通用型检测器，对各物质有几乎相同的响应。消除溶剂的干扰，不受温度变化影响， 灵敏度比较低（尤其对有紫外吸收的组分） 流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。;30;31;在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂， 使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小);4. 选择流动相时应注意的几个问题;34;