大肠杆菌感受态细胞的制备和转化ppt课件.pdfVIP

实验九，十 大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 一. 实验原理 1. 概念 感 受 态 细 胞 在自然条件下 , 很多质粒都可通过细菌接合作用转移 到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种 转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另 一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌， 需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后， 细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转 化 转化 (Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转化过程 转 化 Ø 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异 株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可 以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 Ø 受体细胞经过一些特殊方法( 如电击法,CaCl 2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改 变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 Ø 进入受体细胞的 DNA 分子通过复制 , 表达实现遗传信息的 转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 Ø 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转 化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 常用的感受态细胞制备方法 RbCl(KCl)法， CaCl 法，电击感受态制备等 2 Ø RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高， 但制备较复杂，不适合实验室用 Ø 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电 击仪 Ø CaCl 2 法简便易行 ，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用 时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-7 ℃以下 保存半年，因此CaCl 法使用更为广泛. 2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 CaCl 法制备感受态细胞原理 2 CaCl 法是以Mendel和Higa （197 ）的发现为基 2 础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl 低 2 渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物 中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘 附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞 吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中 保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型， r 如氨苄青霉素耐药（ Amp ）得到表达，然后将此 细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置 培养过夜，即可获得细菌菌落。 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 提高转化效率的几个因素 Ø 细胞生长状态和密度 Ø 质粒的质量和浓度 Ø 试剂的质量 Ø 防止杂菌和杂DNA的污染 大肠杆菌感受态细胞的制备