DNA体外重组技术.pptVIP

同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A （二）DNA连接酶 T4 DNA连接酶 连接反应最适温度12～20℃ 平末端连接温度可适当提高！ T4 DNA ligase （三）DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow聚合酶 －补平、标记探针、合成cDNA 、测序！！ 3 ? ?5 ? 外切活性、聚合活性 Taq DNA聚合酶－PCR 反转录酶－RT-PCR 聚合活性、RNaseH 活性 （四）其它修饰酶 碱性磷酸酶－切除5?端的磷酸基，防止自身环化 末端脱氧核苷酸转移酶－寡核苷酸探针的末端标记 第三节 目的基因的获得 目的基因（外源基因） cDNA /基因组DNA 直接从染色体DNA中分离 化学合成 PCR或RT-PCR体外扩增目的基因 从基因组文库中筛选 向目的基因所有者或其所在的实验室索取 * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备，采用DNA自动合成仪进行. 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库(genomic library) 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 从基因组文库中钓 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库(cDNA library)获取目的基因 　　是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 1985年由穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 PCR：体外由引物介导的DNA酶促合成，也叫基因扩增 变性 退火 延伸 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 第四节 目的基因和载体的连接 粘端－粘端连接 粘端－平端连接 平端－平端连接 其它连接方式 人工接头 T载体 定向克隆 粘端－平端连接 定向克隆的概念 　 The addition of a homopolymer tail (同聚物加尾） ?指应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 重组DNA 技术 (Recombinant DNA technology) 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 重组DNA技术操作过程 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 1.分 2.切 3.接 4.转 5.筛 基因克隆总体技术路线图 第一节 载体（vector） 一、载体的分类 按功能分：克隆型载体、表达型载体 按受体细胞分： 原核细胞载体 真核细胞载体 穿梭载体 按载体来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体、粘粒载体 Definition: allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated mainly at DNA level. 载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记，便