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高效液相色谱法 高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-12g （荧光检测） 第一节 高效液相色谱法的主要类型 及其固定相和流动相 一、主要类型 1.固定相的聚集状态 液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC） 2.分离机制： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 (一)化学键合相色谱法（键合相色谱法） 化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法。 1.键合反应 硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 （3）离子交换键合相： 常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl 3.键合相的性质 含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 三、高效液相色谱法的流动相 对流动相的要求： 1. 与固定相不发生化学反应。 2. 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 3. 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。 4. 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。 （一）流动相对分离的影响 1. 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 溶剂的选择性 溶剂的选择性 多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 固定相：极性键合相 如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 组分的保留和分离 五、反相键合相色谱法 1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等 3.保留行为的主要影响因素 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。 六、反相离子对色谱法（PIC） 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。 离子对模型 影响容量因子的因素 1. 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 2. 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 3. 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。 第二节 高效液相色谱法分离条件的选择 （一）HPLC中的速率理论 涡流扩散　A=2λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相， 匀浆高压填充，以降低A。 纵向扩散　β=2γDm 可以忽略。 因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳， 静态流动相传质阻抗： 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留 静态流动相传质阻抗系数Csm Csm ∝dp2， Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η 要求: 固定相dp2、 流动相η都小 （一）正相键合相色谱法的分离条件 固定相：极性键合相　如氰基、氨基键合相等 流动相：烷烃加适量极性调节剂 （三）反相离子对色谱法的分离条件 固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相 离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH　使试样组分与离子对试剂全部离子化 有机溶剂及其浓度 同一般HPLC 第三节　高效液相色谱仪 输液泵应具备的性能： 流量精度高且稳定