第五章基因工程载体演示文稿.pptVIP

* 3‘ CCCGCCGCTGGA GGGCGGCGACCT 3’ 在黏性末端的12个碱基中，有10个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。 本文档共69页；当前第31页；编辑于星期六\11点21分 * λ噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对λ噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。 λ噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。 本文档共69页；当前第32页；编辑于星期六\11点21分 * λ噬菌体的生长途径 λ噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。 溶原生长途径是指λ噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时， λ噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。 本文档共69页；当前第33页；编辑于星期六\11点21分 * 溶菌生长是指λ噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的λDNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代λ噬菌体颗粒，感染新的细胞。 本文档共69页；当前第34页；编辑于星期六\11点21分 * λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 本文档共69页；当前第35页；编辑于星期六\11点21分 * M13噬菌体 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。 可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍). M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上的混浊噬菌斑. 本文档共69页；当前第36页；编辑于星期六\11点21分 * 噬斑 本文档共69页；当前第37页；编辑于星期六\11点21分 * 单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（－），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时， （＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（－）链。只能生成新的（＋）链。 （＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。 本文档共69页；当前第38页；编辑于星期六\11点21分 * 科斯质粒载体 （cosmid） 又称粘粒载体，简称粘粒。 环形双链DNA分子，一般为4～6Kb。 该载体含有λDNA的cos序列（不少于280个bp）和pBR322质粒的序列。该载体转化效率高。可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制. 本文档共69页；当前第39页；编辑于星期六\11点21分 * 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 属松弛型质粒，拷贝数较多。 本文档共69页；当前第40页；编辑于星期六\11点21分 * 本文档共69页；当前第41页；编辑于星期六\11点21分 * 农杆菌Ti质粒 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。 Ti质粒为双链环状DNA分子，200～250Kb之间。 Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transfer DNA）。 本文档共69页；当前第42页；编辑于星期六\11点21分 * T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。 利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。 本文档共69页；当前第43页；编辑于星期六\11点21分 * 第三节 酵母细胞基因工程载体 酵母是最简单的单细胞真核生物。 酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N－端的甲硫氨酸等。 本文档共69页；当前第44页；编辑于星期六\11点21分 * 酵母菌的克隆载体 YIP 酵母整合型质粒 YRP 酵母复制型质粒 YEP 酵母附加子型载体 CIP 酵母菌着丝粒型质粒 本文档共69页；当前第45页；编辑于星期六\11点21分 * 上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定存在，即所谓的穿梭质粒