第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定详解演示文稿.pptVIP

第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定详解演示文稿 本文档共36页；当前第1页；编辑于星期六\12点55分 优选第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定 本文档共36页；当前第2页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第3页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第4页；编辑于星期六\12点55分 三、?噬菌体的体外包装 *重组体DNA分子的转染(transfection)作用 105~106噬菌斑/?gDNA *体外包装 转导(transduction) 本文档共36页；当前第5页；编辑于星期六\12点55分 天然包装过程 本文档共36页；当前第6页；编辑于星期六\12点55分 体外包装过程 尾部突变-头 头部突变-尾 E-72%?E--累积尾部蛋白 D-与DNA进入头部及头部成熟有关?D--累积头部蛋白 本文档共36页；当前第7页；编辑于星期六\12点55分 四、凯伦噬菌体载体(charon) 两类 特点：酶切位点多、含LacZ、容量大 克隆程序:分离线性噬菌体DNA-酶切分离左右臂+中央区段-与外源DNA混合-包装 几kb~23kb 噬菌体载体及派生载体的优点：感染效率高 本文档共36页；当前第8页；编辑于星期六\12点55分 五、柯斯质粒载体 1、柯斯质粒载体的构建 定义：(cos site-carrying plasmid) eg.pHC79(?+pBR322) cos+与噬菌体包装有关的序列 ori+Ampr+Tetr 容量：31~45kb 本文档共36页；当前第9页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第10页；编辑于星期六\12点55分 2、柯斯质粒载体的特点 *具有?噬菌体的特性（环化） *具有质粒载体的特性 *高容量 3、柯斯克隆 优点：容量大、非重组体少 问题：分子内重组成多聚体（碱性磷酸酶处理） 基因间连接（电泳分级分离） 本文档共36页；当前第11页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第12页；编辑于星期六\12点55分 六、单链DNA噬菌体载体 *M13、f1、fd *优点：双链复制型、单双链均可转染宿主、颗粒大小受DNA多寡制约、易测出插入方向 *M13克隆体系 特性：LacZ、诱导及组成型的LacZ、成对构建（M13mp8、M13mp9） 本文档共36页；当前第13页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第14页；编辑于星期六\12点55分 七、噬菌体展示载体(phage display) 丝状噬菌体（M13/fd)表面-3~5拷贝geneIII产物-颗粒组装及F性须吸附 G.P.Smith-1985建立-在噬菌体表面表达蛋白 应用：噬菌体表面展示文库 *原理 *分离hGH变体 本文档共36页；当前第15页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第16页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第17页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第18页；编辑于星期六\12点55分 八、噬菌粒载体(phasmid) M13类的缺陷： -插入后遗传稳定性下降，且与片段大小有关 -实际上总以正向插入 -容量有限（1500bp） 改进的M13类-噬菌粒 -分子小：3kb -容量10kb -双向性（细菌质粒和phage） 本文档共36页；当前第19页；编辑于星期六\12点55分 本文档共36页；当前第20页；编辑于星期六\12点55分 T3+T7 本文档共36页；当前第21页；编辑于星期六\12点55分 1、?噬菌体载体的类型及其比较。 2、噬菌体的体外包装原理。 3、什么是凯伦噬菌体载体？有怎样的特点？ 4、什么是柯斯质粒载体？有怎样的特点？ 5、单链DNA噬菌体载体的优点。 6、噬菌体展示载体的工作原理。 7、噬菌粒载体的特点。 复习提纲 本文档共36页；当前第22页；编辑于星期六\12点55分 第五章 目的基因的准备、重组及重组子的鉴定 一、cDNA基因文库的构建（汇集生物体所有cDNA序列的重组DNA群体） 1、cDNA基因文库的优点： 病毒RNA 筛选简单 表达 测定基因结构（内含子 外显子）、时间调节基因表达特征分析 2、缺点： 无调节序列 低丰度mRNA克隆难 本文档共36页；当前第23页；编辑于星期六\12点55分 ClerkeCarbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g) 特异mRNA拷贝数/总mRNA种类 可克隆片段大小/基因组总长度 mRNA丰度 克隆基因的大小(载体