放射免疫荧光标记免疫详解.pptVIP

抗体：特异性强、效价高、标记后活性高 标记前：梅花状双扩测效价 标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂） 2. 待标记抗体 1mg/mL 本文档共42页；当前第30页；编辑于星期六\6点27分 FITC（ 异硫氰酸荧光黄）标记抗体Marsshall法原理 当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。 3. 荧光标记抗体制备与纯化  荧光素- FITC- N＝C ＋ N - 蛋白质 FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ ‖ S H H H S H 本文档共42页；当前第31页；编辑于星期六\6点27分  操作流程 抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液） 碳酸盐缓冲液为总量的1/10。 荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC （抗体与荧光素比例为50-100:1） 标记：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃ 透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃ 过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱分离游离荧光素 保存 ：4℃ -40℃等量甘油分装保存。 3. 荧光标记抗体制备与纯化 本文档共42页；当前第32页；编辑于星期六\6点27分 4. 荧光标记抗体鉴定 1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色 2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色 3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性 标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法 F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量， F/P=1-2， 过高------非特异染色增强； 过低------荧光很弱，降低敏感性。 本文档共42页；当前第33页；编辑于星期六\6点27分 经典荧光抗体染色法 本文档共42页；当前第34页；编辑于星期六\6点27分 流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM），以荧光免疫技术为基础发展起来的专门的细胞分析技术。是一项集液流喷射技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 现代免疫荧光技术 1. 流式细胞技术 本文档共42页；当前第35页；编辑于星期六\6点27分 1. 流动室及液流驱动系统 2. 激光光源及光束形成系统 3. 光学系统 4. 信号检测与存贮、显示、分析系统 5. 细胞分选系统  流式细胞仪工作原理 本文档共42页；当前第36页；编辑于星期六\6点27分 荧光染色的细胞（微粒）悬液标本 High Pressure 流动室及液流驱动系统 本文档共42页；当前第37页；编辑于星期六\6点27分 若干组透镜、滤光片、小孔 ---将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器 本文档共42页；当前第38页；编辑于星期六\6点27分 单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。 快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 流式细胞技术应用 本文档共42页；当前第39页；编辑于星期六\6点27分 多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。 定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 流式细胞技术应用 本文档共42页；当前第40页；编辑于星期六\6点27分 1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫技术分析”理论；1984年，Hemmila确定了DELFIA免疫荧光技术方案，从而使DELFIA成为Wall