酶的提取与分离纯化.pptVIP

特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。 本文档共107页；当前第57页；编辑于星期一\4点41分 注意事项：(1)．有机溶剂的选择 乙醇和丙酮是两种最常用的有机溶剂，丙酮比乙醇的介电常数小些，即丙酮的沉淀能力较强。根据一般经验，如30％一40％左右乙醇沉淀的物质，改用丙酮时浓度可减少10％左右，即用20％一30％的丙酮。 本文档共107页；当前第58页；编辑于星期一\4点41分 （2）温度的控制 有机溶剂沉淀的操作过程宜在低温进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷到比操作温度更低，因有机溶剂与水混溶时要放热。在加入有机溶剂时搅拌要均匀适当，以避免局部浓度过高和温度过高而导致的不良影响. 本文档共107页；当前第59页；编辑于星期一\4点41分 （3）离子强度的控制 离子强度在有机溶剂和水的混合液中是一个特别重要的因素。有时当离子强度很小时，物质不能沉淀，如补加少量电解质即可解决。一般可用醋酸铵、醋酸钠或氯化钠等．以溶剂能溶解且不影响提取物的质量为原则。当盐的离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。 本文档共107页；当前第60页；编辑于星期一\4点41分 (4) pH值的控制 pH值影响蛋白质等在有机溶剂中的溶解度。蛋白质等分级沉淀更应严格控制pH值。有时为了防止带相反电荷的蛋白质之间的相互结合，选择pH值时可使大部分蛋白质带有相同的净电荷。 本文档共107页；当前第61页；编辑于星期一\4点41分 (5)．待分离物质的浓度控制 蛋白质等物质浓度越大，加入有机溶剂后，由于溶解降低所引起的浓度差值也越大，蛋白质等沉淀量就越多。此外蛋白质等浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。 本文档共107页；当前第62页；编辑于星期一\4点41分 （6）金属离子的影响 金属离子与蛋白质结合，其结果常使蛋白质的溶解度降低。利用金属离子与生物大分子的反应，常有助于生物大分子的分组分离。例如，有些蛋白质与锌离子等，可形成复合物，这种复合物在水和有机溶剂的混合物中的溶解度较低，易于形成结晶。 本文档共107页；当前第63页；编辑于星期一\4点41分 四、实例 有机溶剂沉淀法制取食品级α-淀粉酶 工艺流程说明： 1.发酵液预处理 2.压滤 3.浓缩 4.沉淀 5.压滤 6.干燥 本文档共107页；当前第64页；编辑于星期一\4点41分 4. 热沉淀 定义 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。 适用对象：热稳定性高的蛋白质 本文档共107页；当前第65页；编辑于星期一\4点41分 5、复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。 本文档共107页；当前第66页；编辑于星期一\4点41分 二、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 本文档共107页；当前第67页；编辑于星期一\4点41分 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 本文档共107页；当前第68页；编辑于星期一\4点41分 1、 离心方法的选择 对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。 超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度