实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化(转).pptVIP

【学科知识点】选择性沉淀法从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白；凝胶层析法纯化鸡卵类黏蛋白粗提液；离子交换柱层析法进一步纯化鸡卵类黏蛋白提取液；透析纯化的方法去除样品中盐类；紫外分光光度法鉴定样品含量及纯度；有机溶剂等电沉淀法获得鸡卵类黏蛋白纯品。本文档共23页；当前第1页；编辑于星期日\13点2分实验内容鸡卵类黏蛋白的提取凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化鸡卵类黏蛋白纯品的制备本文档共23页；当前第2页；编辑于星期日\13点2分鸡卵黏蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。【基本原理】鸡卵类黏蛋白的提取本文档共23页；当前第3页；编辑于星期日\13点2分【操作步骤】1)取1个鸡蛋蛋清，量出体积，加入等体积的10％三氯乙酸溶液，形成类似于酸奶状的白色沉淀，搅拌均匀，在酸度计上检查pH值,若偏离3.5，则要用10％NaOH溶液调至pH3.5室温静置4h。鸡卵类黏蛋白的提取本文档共23页；当前第4页；编辑于星期日\13点2分2)4h后,3000r/min离心10min。收集上清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。滤液量体积，转入500mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置2h。鸡卵类黏蛋白的提取本文档共23页；当前第5页；编辑于星期日\13点2分3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部转移到离心管里，经平衡后以3500r/min离心10min，弃清液，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。4)离心管中加入20mL蒸馏水溶解，将溶解液用SephadexG-25层析柱脱盐。鸡卵类黏蛋白的提取本文档共23页；当前第6页；编辑于星期日\13点2分蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化【基本原理】本文档共23页；当前第7页；编辑于星期日\13点2分凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化凝胶层析分离原理示意图本文档共23页；当前第8页；编辑于星期日\13点2分1）凝胶的处理量取100mLSephadexG-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。上柱前用真空干燥器抽气。【操作步骤】凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化2）装柱将柱子垂直地安装好，关闭层析柱出水口，将脱气后的凝胶缓缓地倒进柱内，使之自然沉降。本文档共23页；当前第9页；编辑于星期日\13点2分3）平衡打开核酸蛋白检测仪、记录仪电源，将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连，开启柱口下夹子，用约2倍体积的pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线。凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化本文档共23页；当前第10页；编辑于星期日\13点2分本文档共23页；当前第11页；编辑于星期日\13点2分本文档共23页；当前第12页；编辑于星期日\13点2分4)上样取样品溶解液上SephadexG-25层析柱。控制流速15d/min，收集蛋白峰。即可得到鸡卵类黏蛋白粗提液。并准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化本文档共23页；当前第13页；编辑于星期日\13点2分本文档共23页；当前第14页；编辑于星期日\13点2分【基本原理】初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。得到鸡卵类粘蛋白的纯溶液。然后经透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可获得鸡卵类粘蛋白纯品。鸡卵类黏蛋白纯品的制备本文档共23页；当前第15页；编辑于星期日\13点2分1)量取已处理的DEAE-纤维素50mL，用60mLpH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，脱气。2）装柱将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。【操作步骤】鸡卵类黏蛋白纯品的制备本文档共23页；当前第16页；编辑于星期日\13点2分4)洗脱改用含0.3mol/LNaCl的pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。3)上样吸附