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分子诊断的临床应用;用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。
上世纪70年代人们开始在实验室进行研究,80年代以来,基因检测在许多国家已成为常规检验项目,主要用于感染性和遗传性疾病等的诊断。;1953年Watson和Crick提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型。
1990年人类基因组计划正式启动。
2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图。;DNA重组技术(DNArecombination)转基因技术(transgenictechnique)基因组学(genomics)
蛋白组学(proteomics)基因治疗(genotherapy)生物芯片(biochip)等技术
已应用到医学领域,对疾病机理的认识、疾病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。;分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断,也能确定个体对疾病的易感性,判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。
分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分,成为一门新的学科。;一、基因检测在感染性疾病中的应用;SARS相关冠状病毒的分子诊断;·2003年4月,德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术,获得一段长度为300bp的核苷酸序列。;第1页/共103页;检测标本
痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液
、血浆、粪便。
检测方法
逆转录-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)
逆转录-实时PCR(Reverse-RealtimePCR);第11页/共103页;有报道显示,在可能SARS病人中病毒的检出率为100%。
在疑似SARS病人中的检出率为23%。所有健康接触者中未检测到病毒。;第13页/共103页;另一项研究显示
检测病毒的3种方法(血清学检测、病毒分离、PCR技术)中,PCR技术的检出率最高。;第15页/共103页;讨论;讨论;SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题;肝炎病毒基因的检测;预后判断
病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。
垂直传播途径感染者,预后较差。
反映肝细胞损害的其它指标正常,但病毒核酸水平经常波动者更易发展为肝硬化。;病毒分型和耐药检测;HPV基因的检测在预防宫颈癌中的作用;宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位,每年约有50万左右新发病例。;持续的人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素,93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。
高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。;HPV DNA的检测方法
实时定量PCR (Real time PCR)
核酸杂交捕获(Hybrid CaptureⅡ,HCⅡ);HC Ⅱ可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。敏感度:对CIN Ⅱ、Ⅲ和癌的检出率为 98%。阴性预期值:对高度鳞状上皮细胞病变或更高度;细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时,HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。;基因检测在监测移植物排斥中的作用;关于多瘤病毒;在美国,10岁以上的正常人群中60%~80%有BK病毒感染史。
感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞中。
BK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大量使用免疫抑制剂后。;肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂,使BK病毒重新激活,大量复制。
BK病毒复制进一步发展,成为BK病毒感染的肾间质性肾病(BKVAN)。
BKVAN患者中60%~70%会发生远期的肾脏移植失败。;第32页/共103页;BK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的重要原因之一。;早期无临床症状,后期症状与肾移植排斥和药物毒性反应相似,易引起误诊和漏诊。
BK病毒感染和移植排斥治疗原则相反:BK病毒感染需要降低免疫抑制剂量,而移植排斥则应加大用量。;因此,建立有效的BK病毒检测和监测体系
是十分必要的。;decoy细胞
BK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。形态学检测敏感性较好,但特异性差。
细胞形态在尿液中很容易破坏。;巴氏染色的decoy细胞;BK病毒感染的检测;肾脏移植术后病人BK病毒检测的研究;Decoy细胞形态学特征:
小管上皮细胞的细胞核明显增大,多偏向一侧,核浆比例明显增加;细胞边缘常常出现毛玻璃样改变;胞浆有细小颗粒,较均匀,呈果冻状;细胞核常较粗糙。;结果;尿液中BK病毒核酸定量检测
14例尿液中检测到BKVDNA,病毒载量为
4×103~2×109/ml,平均为5.6×105/ml。
发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。;血
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