第五节 中和试验.docx

第十一章 血清学试验第五节 中和试验

根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralizationtest）。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。

体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。

体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。

毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。

一、终点法中和试验

终点法中和试验（Endpointneutralizationtest）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。

(一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。

病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈

直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD

)作为毒价单位，而且LD

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的计算应

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用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作为指标

的，可用半数感染量(ID

)。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD

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)或鸡胚

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半数感染量(EID)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID

)。在

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测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD

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)或半数保护量(PD)。

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病毒毒价测定将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3……，选择4～

6个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组3～6只(个、孔)。接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。

以TCID测定为例说明如下：

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按Karber法计算，其公式为lgTCID=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对

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数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固

定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组死亡（感染）数/试验数相加。

若以测定某种病毒的TCID

为例，病毒作10-4～10-7稀释，记录其出现细胞病

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变（CPE）的情况（表11-1）。则L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16

lgTCID

=(-4)+(-1)×(2.16-0.5)=-5.66。TCID

=10-5.66，0.1ml。

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TCID

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为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.66（1/105.66）时，每孔细胞接

种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少

TCID或（LD

等）表示。如上述病毒的毒价为105.66TCID/0.1ml，即106.66TCID

/ml。

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表11-1 病毒毒价滴定(接种剂量0.1ml)

病毒稀释

阳性数

CPE

阴性数

%

10-4

6

0

100

10-5

5

1

83

10-6

2

4

33

10-7

0

6

0

正式试验 将病毒原液稀释成每一单位剂量含200LD

(或EID、TCID)，

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与等量递进稀释的待检血清混合，置37℃感作1h。每一稀释度接种3～6只（个、

管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组动物的存活数和死亡数，同样按

Reed-Muench法或Karber法计算其半数保护量（PD），即该血清的中和价。

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(二)固定血清稀释病毒法 将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列无菌试

管，第一列加等量正常血清(对照组)，第二列加等量待检血清(中和组)；混合后置37℃感作1h，每一稀释度接种3～6只试验动物(或鸡胚、组织细胞)，记录每

组动物死亡数、累积死亡数和累积存活数（表11-2），按Karber法计算LD，

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然后