体内药物分析------第七章---免疫分析法概要课件.pptxVIP

第七章 免疫分析法;【大纲要求】;第一节：概 述;免疫分析法(Immunoassay，IA)：是指以特异性抗原－抗体反应为基础的分析方法。

1959年，由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来，首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量，从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)。

酶免疫分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、时间分辩免疫分析方法等。;一、基本原理;抗原－抗体反应须满足以下条件：;;(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线);B/F-[Ag];(三)抗原一抗体反应的特点;2．可逆性;3．最适比例性;二、基本条件;1．全抗原与半抗原

全抗原：同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。半抗原(Hapten)：只能与特异抗体作用但不引起

机体免疫应答的物质。

人工完全抗原：药物(半抗原)本身不具免疫原性，只有当它们与某些???分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小分子半抗

原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原。;2．人工抗原的制备;(3)载体与半抗原的结合;② 混合酸酐法;③ 戊二醛法;⑤ 重氮化的对氨基苯甲酸法;3．人工抗原的鉴定;光谱分析法

结合物水解后，光谱法测定水解药物和蛋白质的含量，从而推算出它们的分子结合比。

化学分析法

利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚，测定蛋白质与

半抗原结合前后游离氨基数目的差别。反应出蛋白质与药物的结合程度，可求出结合物中药物的含量。(3)放射性同位素标记法

在制备人工抗原时，在已知量的药物中加入定量

的放射性同位素标记药物，然后通过测定结合物中的放射性强度，便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例。;4．标准抗原(Standardantigen);(二)特异抗体的制备及鉴定;2．抗体的制备;(1)免疫原的制备;(2)免疫接种动物;(3)抗血清的获得;3．抗体的鉴定;当抗血清稀释度足够低时，其结合率趋于极值，该值称为“过量抗体结合率”(标记药物全被结合)，如图中曲线的AB段，可用来衡量标记药物的质量。自AB段以后，随着抗血清稀释倍数增大，其标记药物的结合率逐渐降低，实际工作中多采用结合率为50％时(C点)的抗血清稀释度(D点)。;(2)活度(Avidity);(3)特异性(Specificity);三、方法分类;荧光免疫分析法;2．按是否加入分离剂分;第二节 放射免疫分析;放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)：

利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。

特点：

灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测;一、放射性同位素标记抗原;1．放射性强度

放射性强度(严格说应为放射性活度)：每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(desintegrationper-second，dps)，其单位为贝可(Bq)。1贝可相当于每秒1次核衰变，即lBq=1dps。;2．放射性比度;3．放射性化学纯度(放化纯度);(二)标记抗原(IabeledAntigen);1．对标记抗原的一般要求;2．标记放射性同位素的选择;(三)标记方法;2．3H标记抗原的制备;10/23/2023;二、F与B的分离技术;(一)沉淀法

用蛋白沉淀剂将抗体沉淀，从而可使与蛋白(抗体)相;(二)吸附法;原理：

DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用，使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附，而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中。

方法：

当免疫反应达到平衡后，于反应液中加入DCC吸附剂，待吸附达平衡后，离心。离心后的结果正好与沉淀法相反，上清液中是与抗体相结合的标记药物(B)，而沉淀中则是游离的标记药物(F)。

优点：快速、简便

缺点：如药物一抗体结合物的离解常数较高时，测定结果不稳定。;(三)固相法;方法：

采用试管固相法，即将抗体直接附着于试管底部的内壁上，测定时于试管中加入样品和试剂，当放射免疫反应达到平衡后，结合物就附在管壁上，游离抗原则留

在液相中。通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离。

优点：简便、快速、实用。

缺点：有时难以获得重复的结合率，其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物，导致结果误差增大。;(四)双抗体法;优点：分离效果好，适用范围广。

缺点：抗体的制备有一定难度，且操作流程较长。;三、放射免疫测定仪;(一)测量原理;1．溶剂;2．闪烁剂;(二)仪器简介;1．计数瓶;2