酵母蔗糖酶的提取及其性质研究--精品课件.pptVIP

柱上操作⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。

⑵上样向层析柱内倾入样品液⑶洗涤杂蛋白(4)洗脱与收集

不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。*ppt课件离子交换柱层析纯化蔗糖酶操作步骤1.离子交换剂的处理：DEAE-SepharoseFastFlow离子交换剂保存在20%乙醇中，使用前去除乙醇后，用去离子水洗涤3～5次。DEAE-SepharoseFastFlow层析柱柱料昂贵，用后务必回收，重复操作时，按“1mol/LNaCl去离子水”的顺序洗即可。如果交换剂过度污染，再生时用0.5mol/LNaOH浸泡30min，用蒸馏水洗到中性，再用1mol/LNaCl浸泡30min，用蒸馏水洗到中性。最后保存在20%的酒精溶液中。*ppt课件2.装柱与平衡：先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）*ppt课件*ppt课件3.上样与洗脱：上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml0.02MpH7.3的Tris-HCl缓冲液和30ml含1MNaCl的0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml量杯，一个装30ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入30ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。*ppt课件用2ml0.02MpH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，若溶液混浊，则用小试管，10000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管3.0ml/3min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速3.0ml/3min。*ppt课件测定每管洗脱液的A280光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出总体积，此即“柱级分IV”。注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。*ppt课件各级分蛋白质含量的测定采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见实验－“蛋白质含量的测定法”。各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考：粗级分I：30倍热级分II：20倍醇级分III：3倍柱级分IV：2倍*ppt课件123456(稀释的粗级分Ⅰ)7(稀释的热级分Ⅱ)8(稀释的醇级分Ⅲ)9(稀释的柱级分Ⅳ)标准蛋白质溶液(ml)00.020.040.060.08待测样品(ml)0.10.10.10.1双蒸水ml0.10.080.060.040.020000考马斯亮蓝ml333333333A595蛋白质含量的测定标准蛋白质浓度：1mg/ml*ppt课件实验结果计算根据标准曲线求出稀释后的酵母蔗糖酶各级分的蛋白质浓度(mg/ml),乘以稀释倍数,求出所提取的酵母蔗糖酶各级分的蛋白质浓度(mg/ml)和总蛋白含量(乘以量取的各级分的上清体积,mg).*ppt课件酵母蔗糖酶各级分活性的测定*ppt课件*ppt课件ppt课件吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。弱吸附剂：蔗糖、淀粉；中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等；