流式细胞术的操作、原理与应用.pptxVIP

流式细胞术

---原理、操作及应用;主要内容;1.1流式细胞术简介;流式细胞术的特点;流式细胞仪的分类;流式细胞仪的发展及商品化;BD公司分析型流式细胞仪;BD公司分选型流式细胞仪;1.2流式细胞术光信号检测;1.2.1散射光信号;（二）侧向散射光SSC;（三）散射光的作用;;1.2.2荧光信号;（二）常用荧光素;核酸荧光染料

PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。

7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。

DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。

Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。

PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。

AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。;1.3流式细胞仪的结构组成;1.3.1液流系统;1.3.2光学系统;（二）光收集系统;全反射光路;1.3.3电子系统;（一）光电检测器(photodetector);（二）电信号两种放大方式;（三）荧光信号的面积A、宽度W和高度H;;光信号电信号数字信号;通道(channel)

一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：

散射光通道:FSC通道和SSC通道；

荧光通道

通道命名方式：

以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。

以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。

Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。;1.3.4流式分选;四路分选原理;分选指标;分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。

分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般???达99%以上。

分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。

分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。

富集模式(enrichmode)

纯化模式(purifymode)

单细胞模式(singlecellmode);1.4荧光抗体的选择;B根据抗原表达强弱合理选择抗体

不同的荧光素强度有所不同；

高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：

CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE

;1.5FCM数据存储、显示与分析;FCM数据显示方式;直方图Histogram;横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。;散点图;散点图和伪彩图;等高图和密度图;假三维图和三维图;设门与数据分析;矩形;十字门;二、流式细胞术操作与技巧;;2.1单细胞悬液制备;酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：

胰蛋白酶—水解酯键、肽键；

胶原酶—降解几种分子类型的胶原；

溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷键；

弹性蛋白酶—消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。

将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒温37℃或室温），间断振荡或吹打；

终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；

将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。

注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。;机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。

;化学处理法：

作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。

EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。

特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。

;

机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的