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荧光蛋白的研究

荧光蛋白的发展简史1荧光蛋白的结构2荧光蛋白的分类3荧光蛋白的应用4结论与展望5

下村修1962年在维多利亚多管水母体内发现了绿色荧光蛋白(GFP)，并进行纯化。马丁·沙尔菲第一次运用绿色荧光蛋白这个神奇工具投入试验研究。1994年，改造GFP，使其荧光变强、变色。钱永健荧光蛋白的发展简史

荧光蛋白的结构图1.野生型avGFP的结构

荧光蛋白的分类蓝色荧光蛋白青色荧光蛋白绿色荧光蛋白黄色荧光蛋白橙色荧光蛋白红色荧光蛋白远红光荧光蛋白表1.部分荧光蛋白及其基本性质

1.亮度高的荧光蛋白蓝色荧光蛋白EBFP发光较弱，抗光漂白和抗酸性较差，用于细胞成像时背景信号高。几个课题组针对EBFP开发了3个更亮的突变体：Azurite，EBFP2，mTagBFP。荧光蛋白的应用荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成像检测灵敏度密切相关。图2.Azurite突变体图3.EBFP2突变体

红色系列荧光蛋白对于橙色与红色系列荧光蛋白，较早报道的红色荧光蛋白(DsRed)的突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry和mCherry。这些以水果命名的荧光蛋白表现出不同的光谱和理化特性，其中红色荧光蛋白mCherry成熟快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较低。图4.红色荧光蛋白荧光蛋白的应用

由于荧光蛋白的发光团结构决定了它的光谱特性，从结构上来设计荧光蛋白的突变位点，有可能获得可见光光谱两端的荧光蛋白突变体。开发深红色或者近红外荧光蛋白对于活体生物成像更具价值。由于机体组织内的血红素在可见光波段有强吸收，而水和脂肪在红外波段有强吸收，仅在近红外光波段(650～900nm)的吸收系数最小且自发荧光最弱，被认为是活体成像的“光学窗口”。2.可见光光谱两端的荧光蛋白荧光蛋白的应用通过GFP-Phe66突变获得了一个深蓝色的荧光分子，但它的量子产率太低而无法使用。进一步对其突变T65Q、Y145G、H148ST203V位点后，得到了深蓝色荧光蛋白Sirius，亮度比GFP-Phe66提高了25倍。图5.深蓝色荧光蛋白Sirius

图6.mKeima荧光蛋白荧光蛋白的应用3.大stokes位移的荧光蛋白mKeima是最早报道的大Stokes位移的红色荧光蛋白，它的发射与吸收峰分别位于440和620nm处。采用458nm的光源同时激发CFP与mKeima两个荧光分子，能实现单光源的多色成像及荧光相关光谱(FCS)分析。但mKeima有两个激发峰，另一个在584nm处，这不利于它的多色成像。

不可逆光活化荧光蛋白荧光蛋白的应用4.光转换与光活化荧光蛋白Dronpa来源于Cnidaria，在强的蓝光(470～510nm)作用下荧光淬灭形成暗态的分子。暗态的Dronpa在390nm处有吸收峰，受到400nm左右光照射时发生光活化，可回到起初的绿色荧光态，这种转化可以反复多次进行。可逆光活化荧光蛋白最早报道的光活化荧光蛋白PA-GFP，属于不可逆光活化荧光蛋白类。它经过405nm的紫色光激活后，再用488nm的光激发成像，此时的发射光比激活前增强100倍，因而光活化区域与周边未活化区域形成了很高的荧光对比度，为活细胞内动态研究蛋白质分子的扩散运动提供了有效方法。图7.PA-GFP的光敏化和活体成像图8.PA-GFP的CLSM图9.Dronpa光致变色的性质

结论与展望本文主要介绍了荧光蛋白的发展，结构及分类，以及其在亮度、Stokes位移、光谱等特性方面的研究与发展，在光转换与光激活荧光蛋白及其在超分辨荧光成像技术中的应用。活体成像深度仍有局限性，为了提高分辨率，需要优化出更合适于活体荧光成像的高亮度近红外荧光蛋白分子。新型光学成像技术迫切需要具备新特性的荧光分子与之结合，以更大程度地提高成像的时空分辨率和检测灵敏度。结论展望

1.ShanerNC,.Improvedmonomericred,orangeandyellowfluorescentproteinsderivedfromDiscosomasp.redfluorescentprotein.NatBiotechnol,2004,22:1567~1572.2.ShroffH,GalbraithCG.Dual-colorsuperresolutionimagingofgeneticallyexpressedprobeswithinindividualadhesionco