细胞培养技术--精品课件.pptVIP

细胞传代3贴壁细胞传代采用酶消化法传代。常用的0.25％的胰酶。吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，37℃消化1分钟左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。注意：开放式操作，小心谨慎、谨防污染！*ppt课件细胞冻存（慢冻）1细胞冻存液（1ml/管）基础培养基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）2细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1-8x106cells/ml缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。*ppt课件细胞冻存3慢冻程序传统方法：4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16－18小时（或过夜）→液氮长期保存。程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。*ppt课件细胞冻存*ppt课件小结四细胞培养过程细胞生长类型及传代方法细胞培养过程注意无菌操作（全程）准备工作复苏（快）传代（无菌）冻存（慢）实验细胞信息、方法冻存液成分、培养基、耗材程序*ppt课件细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞*ppt课件细胞培养技术*ppt课件细胞培养也叫细胞克隆技术。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。什么是细胞培养？*ppt课件主要内容实验设备试剂及耗材清洗及灭菌细胞培养（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）*ppt课件一实验设备超净工作台，生物安全柜CO2培养箱倒置显微镜离心机电热恒温水槽液氮罐纯水仪压力蒸汽消毒器电热干燥箱*ppt课件超净台生物安全柜酒精灯（√），离开要熄灭！酒精灯（×）*ppt课件CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。倒置显微镜*ppt课件离心机电热恒温水槽液氮：-196℃液氮罐*ppt课件纯水仪压力蒸汽灭菌器电热干燥箱由工作人员操作，注意安全！*ppt课件小结一实验设备及功能（酒精灯安全）*ppt课件二试剂及耗材培养基缓冲液消化液血清其他耗材*ppt课件培养基供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。成分及作用：氨基酸：组成蛋白质的基本单位碳水化合物：能量来源无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用*ppt课件培养基分类DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：间充质干细胞，单抗细胞融合RPMI1640：血液细胞（HL60）、一些实体瘤细胞（BT474）酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。ATCC/美国模式培养物集存库*ppt课件缓冲液（洗涤细胞）PBS：磷酸缓冲盐溶液——具有pH缓冲作用的等渗盐溶液（常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面的研究。Hanks：平衡盐溶液——无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。?D-Hank’s：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。*ppt课件消化液胰蛋白酶溶液使细胞间蛋白质水解、细胞离