唾液酸含量测定法.docx

附录 唾液酸测定法

(间苯二酚显色法)

本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。

唾液酸对照品溶液（200μg/ml）的制备 精密称取唾液酸对照品10.52mg（1μg唾液酸相当于3.24nmol），置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液（1mg/ml），按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。

测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度约为每1ml含0.2～0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀，每管再加入间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2%间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μl、25%盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制）1ml，加盖，沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm)，取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后，每管加乙酸丁酯-丁醇液（取乙酸丁酯4份与丁醇1份混匀,室温下保存,12小时内使用）2ml，充分混匀，室温放置10分钟，照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA），在波长580nm处测定吸光度。

唾液酸/μ

g

供试品

空白

2

4

5

6

8

唾液酸对照品溶液/μ

l

10

20

25

30

40

水/μl

100

90

80

75

70

60

供试品溶液/μl

100

用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归（相关系数应不低于0.99），由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度，再按下式计算

供试品唾液酸含量

(mol/mol蛋白质) ＝A×5×3.24×W×D

2

A×P×100

1

式中A为5μg唾液酸的吸光度；

1

A为供试品的吸光度；

2

D为供试品稀释倍数；

P为供试品蛋白质含量，μg/μl；W为1nmol促红素的量，相当于

1