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WB原理及操作注意事项详解汇报人：AA2024-01-29

目录WB技术概述WB操作前准备WB操作步骤详解WB操作注意事项WB结果分析与解读WB技术应用拓展

WB技术概述01

WesternBlot，即蛋白质印迹，是一种用于检测在样本中特定的蛋白质的技术。自20世纪70年代末诞生以来，WB技术已成为分子生物学、生物化学和免疫遗传学中研究蛋白质的重要工具。定义发展历程WB技术定义与发展

疾病诊断检测生物样本中特定蛋白质的异常表达，辅助疾病的诊断。基础研究用于研究蛋白质的表达、翻译后修饰、蛋白质相互作用等。药物研发评估药物对蛋白质表达或功能的影响，筛选潜在的药物靶点。WB技术应用领域

样本制备将待测样本（如细胞、组织等）破碎并提取总蛋白质。蛋白质分离通过SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白质按分子量大小分离。蛋白质转移将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜）上。抗体孵育与检测使用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过酶联反应或化学发光等方法检测抗体-蛋白质复合物。WB技术基本原理

WB操作前准备02

保持室内清洁，避免灰尘和杂质污染实验设备和试剂。温度控制在20-25℃，相对湿度保持在40%-60%之间，以确保实验的稳定性。使用高质量的电泳仪、转膜仪和成像系统。确保电源稳定，接地良好，以避免设备故障和实验误差。实验室环境设备要求实验室环境与设备要求

试剂与材料准备试剂准备所需的抗体、封闭液、洗涤液、显色液等。确保试剂质量可靠，按照厂商推荐的保存条件进行存储，并在有效期内使用。材料准备适合的固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）、滤纸、海绵等。确保材料无杂质、无污染，并按照实验需求进行裁剪和处理。

根据实验需求，对样品进行适当的处理，如蛋白提取、定量、变性等。确保处理过程规范、准确，避免蛋白降解或修饰。样品处理处理后的样品应妥善保存，避免反复冻融和长时间存放导致的蛋白降解。根据实验需求，可选择适当的保存方法，如-80℃超低温冰箱保存或液氮保存等。样品保存样品处理与保存

WB操作步骤详解03

分离胶制备选择合适的分离胶浓度，根据目的蛋白的分子量大小选择10%-20%的分离胶。按照配方依次加入各成分，充分混匀后迅速灌入玻璃板间，避免产生气泡。浓缩胶制备在分离胶上层加入浓缩胶，一般为5%的浓度。同样需要充分混匀并迅速灌入，插入梳子，避免产生气泡。分离胶与浓缩胶制备

样品处理01将蛋白样品与上样缓冲液混合，加热变性后冷却至室温。02上样将处理好的样品按照预定顺序加入上样孔中，注意避免样品溢出。03电泳连接电源，设置合适的电压和时间进行电泳。一般先以低电压使样品在浓缩胶中压缩成一条线，然后加大电压使样品在分离胶中分离。样品上样与电泳

转膜与封闭将PVDF膜浸泡在甲醇中活化，然后和滤纸、海绵一起浸泡在转膜缓冲液中。转膜按照“三明治”结构依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，注意排除气泡。将转膜夹放入转膜槽中，加入转膜缓冲液和冰盒，连接电源进行转膜。封闭转膜完成后，将PVDF膜取出放入封闭液中，室温封闭1小时或4℃封闭过夜。转膜准备

一抗孵育01将封闭好的PVDF膜放入一抗稀释液中，室温孵育1小时或4℃孵育过夜。然后用TBST洗涤3次，每次5分钟。二抗孵育02将PVDF膜放入二抗稀释液中，室温孵育1小时。然后用TBST洗涤3次，每次5分钟。显色03将ECL发光液的A液和B液等体积混合，均匀滴加在PVDF膜上，避光反应1-2分钟后放入成像仪中进行曝光显色。抗体孵育与显色

WB操作注意事项04

防止污染与交叉反应01保持实验室和操作台清洁，定期消毒，避免灰尘和微生物污染。02使用一次性手套和无菌操作工具，避免交叉污染。样品处理过程中，注意防止蛋白质降解和污染，确保样品纯度和完整性。03

01根据目标蛋白的特性和实验需求，选择合适的抗体、封闭液、洗涤液等试剂。02优化抗体稀释比例和孵育时间，确保抗体与目标蛋白充分结合。控制转膜时间、电压和温度等参数，确保蛋白质从凝胶有效转移至膜上。优化实验条件与参数02

无信号或信号弱检查抗体有效性、增加抗体浓度或延长孵育时间；优化转膜条件。条带变形或拖尾检查凝胶制备和电泳条件，确保凝胶均匀、电泳缓冲液新鲜。背景高增加洗涤次数和时间，降低封闭液浓度，减少抗体孵育时间。膜破损或脱落检查转膜过程中是否有气泡或折叠，确保膜与凝胶紧密接触。常见问题及解决方案

WB结果分析与解读05

观察条带检查每个样本的条带是否清晰、连续，有无拖尾或模糊现象。记录位置记录每个条带在膜上的位置，以便后续分析和比较。拍照留存对结果进行拍照或扫描，保存原始数据。结果观察与记录

01数据提取从条带中提取定量数据，如灰度值、光密度等。02数据处理对数据进行归一化、标准化等处理，以消除实验误差。03统计分析运用适