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细胞复苏及冷冻

细胞培养基及冻存液的配制

细胞培养基的配制,

注意事项,为了避免不小心污染造成的浪费，一般用50ml管分装配制。配置比例,45ml培养基,90%的总体积比例,+5mlFBS,血清,10%的总体积比例,+500μL双抗,1:100的比例,

双抗,链霉素+青霉素——抑制细菌生长。

细胞冻存液的配制,

配置比例,5mlDMSO(100%纯度，以10%总体积的比例)+45ml已配好的培养基,90%的总体积比例,

注意事项,刚配好的细胞冻存液会发热，需用封口膜封住瓶盖后,防止细菌污染,放入冰箱冷冻后再使用。过热的冻存液会使得细胞死亡,,

冻存液一般提前一天配好即可，放置太久会

DMSO二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide):是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，因其抗冻作用，可用于细胞的冻存;

细胞冻存

操作步骤,

1、打开水浴锅，将培养基和冻存液用封口胶封好加热至37?。2、用酒精喷壶消毒,手及洁净工作台表面,进入工作台为防止污染均需酒精喷壶消毒,;从培养箱中取出要冻存细胞的培养皿。

3、用移液管吸出培养基，弃至废液缸,注意移液管勿碰到废液缸壁或其他物品,避免污染,移液管用完后倒插放置待用,。

4、在培养皿中加入约10ml的PBS缓冲液冲洗，用移液管吸除,移液管此时可levelkeepinclevel;needspecialnoteofis,TrafficbottlenecksintheworstplaceattheintersectionofbothendsofthebridgeovertheRiver,apartfrombothendsofthebridgecrossingtheclasscanddlevel,severalotherbridgesatbothendsconnectedtotheWestCrossatleastoneendofservicelevelsatgradeeorabove,andSouthGate

以扔掉,，若有剩余的少量液体，用移液枪吸除。

5、加入1ml的TE，使得细胞消化,解除贴壁状态,，摇匀液体后放入培养箱中5min。

6、镜下观察细胞是否消化,即由扁平的伸展状态变回圆润的收缩状态,此步骤不可省略,。

7、在每个培养皿中均加入4ml培养基，打匀后吸入50ml离心管,因为培养皿多,15ml离心管显然不够用,离心5min,8000rpm,。

8、等待离心的同时，准备冻存盒。

8.1、若冻存盒是从冰箱中拿出，一定要升至室温之后再使用。,水浴锅加热,

8.2、检查冻存盒中是否有异丙醇。,异丙醇的作用是均匀缓慢降温,9、标记好冻存管，细胞系名称、冻存人、冻存时间。

10、取出离心后的离心管弃上清，尽量吸取干净，但不要把细胞吸入。加入冻存液，原则上每盘培养皿分3管，每冻存管加1ml冻存液。

11、打匀后加入冻存管。

12、记得检查冻存管盖子是否拧紧。

13、先放入,80?冰箱保存，接着放入液氮保存。

大量细胞东村是，最好3盘一次操作，防止最后分装冻存管时，demo对细胞的损害

细胞复苏

操作步骤,

1、从液氮中取出细胞冻存管，放入37?水浴锅中迅速融化成液态。,速融慢冻,2、将溶解的细胞倒入15ml离心管，加入3ml培养基，离心5min。3、取10cm培养皿一只，在其内加入10ml培养基，并做好标记。4、离心管弃上清。

5、从培养皿中吸取1ml培养基至离心管中打匀后，均匀加入培养皿。6、行十字法晃动，使得细胞均匀散布，在镜下观察确认。

7、放入培养箱，箱内再行一次十字法晃动。

细胞复苏冻存的原则——快速融化,缓慢冷冻

levelkeepinclevel;needspecialnoteofis,TrafficbottlenecksintheworstplaceattheintersectionofbothendsofthebridgeovertheRiver,apartfrombothendsofthebridgecrossingtheclasscanddlevel,severalotherbridgesatbothendsconnectedtotheWestCrossatleastoneendofservicelevelsatgradeeorabove,andSouthGate

必须将冻存在