基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法.pptxVIP

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法江西省临床检验中心基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第1页。应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第2页。经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第3页。由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第4页。临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第5页。临床标本的处理基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第6页。血清（浆）标本一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第7页。HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第8页。HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用,且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清进行检测，或-20oC保存。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第9页。全血标本通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第10页。前处理：1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来。3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第11页。SDS可与蛋白质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过程中必须除去。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第12页。痰标本痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第13页。具体方法：用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化取1.5mlEP管，加0.5ml液化痰液，再加0.5ml4%NaOH室温放10分钟基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第14页。12000rpm，离心15分钟弃上清，加无菌生理盐水1ml，混匀，12000rpm离心5分钟弃上清，沉淀物用于DNA提取基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第15页。棉拭子用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第16页。具体方法：加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm，离心5分钟用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第17页。同上，重复洗涤一次弃上清，沉淀即可用于DNA提取基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法全文共60页，当前为第18页。5．体液体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用红细胞裂