低温诱导植物细胞染色体数目加倍.docx

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一、实验目的

低温诱导植物细胞染色体数目加倍

了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的作用。

应用植物染色体制片技术，鉴别诱导后染色体数目变化。

学会探究性实验的设计方法。

二、实验原理

通过低温阻碍细胞内酶促反映的进行，从而导致细胞分裂时形成纺锤体所需ATP的供应途径受阻，使细胞分裂过程中完成染色体加倍而细胞不能分裂，达到染色体数目加倍。

从理论上讲，观察染色体数目的最佳时期是分列中期，可当纺锤体的行成受到抑制时，细胞分裂就停止在了前期，不再出现中期、后期，只有当细胞分裂进入到第二周期的中期时，才能确保低温诱导染色体数目变化的成功。因此，低温处理的时间至少要有一个半周期的时间。低温抑制了纺锤体的形成，同时也降低了酶的活性，细胞分裂的速度减慢，细胞周期会延长。

三、实验仪器与试剂

1. 材料：蚕豆 2.试剂：秋水仙素 3.仪器：超低温冰箱

四、实验步骤与方法

培养根尖蚕豆种子于30℃～40℃水浴中浸种3～4h后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每2d换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的1/3。

低温诱导处理待实验材料长出约1cm左右根时，将实验材料平均分两组:实验组于2℃的冰箱中进行低温诱导培养36h后(换水时注意用2℃的水，减小实验的误差)，于

15℃～20℃恢复常温培养10～12h(即小于实验材料一个细胞周期的时间)。对照组于

15℃～20℃常温进行培养，注意经常换水。

取材、固定、解离、漂洗与染色常规“植物细胞有丝分裂”制片方法［1］。

显微观察与数据统计分析随机观察并统计10个视野中分裂期和非分裂期细胞，计算分裂指数(mitoticindex，MI)。细胞分裂指数=分裂期细胞数/全部细胞数×100%。统计数据进行卡方检验。

五、实验记录

(1)培养根尖蚕豆种子于30℃～40℃水浴中浸种3～4h后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每2d换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的1/3。

(2)低温诱导处理待实验材料长出约1cm左右根时，将实验材料平均分两组:实验组于2℃的冰箱中进行低温诱导培养 36h后(换水时注意用 2℃的水，减小实验的误差)，于

15℃～20℃恢复常温培养 10～12h(即小于实验材料一个细胞周期的时间)。对照组于

15℃～20℃常温进行培养，注意经常换水。

取材：待蚕豆根尖长至2cm时取其根尖顶端（0.5-1cm）

预处理:将取下的根尖置于盛有对二氯笨饱和水溶液的青霉素瓶中，浸泡处理3-4h。

固定：经过预处理的根尖，用水清洗，用甲醛-冰醋酸（3：1）固定溶液固定6-24h,固定材料可转入70%酒精中，于4℃冰箱中保存备用。

解离：倒去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次。

染色：将根尖放在载玻片上，切下顶端1-2mm,滴加石炭酸品红溶液进行染色，5min左右即可。

压片：盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散。

镜检观察：在显微镜下仔细观察，寻找染色体轮廓清晰、适中、分散而不重叠的分裂中期相。

封片：拔压好的染色体标本放在冰箱冷冻室，然后用刀片将盖玻片快速掀开，盖玻片和载玻片同时于37℃左右的烘箱中烘干。载玻片、盖玻片经二甲苯透明，滴中性树胶，即制成永久制片。载玻片、盖玻片分别用新的盖玻片、载玻片封片。

六、实验结果与讨论

本实验根据低温诱导染色体加倍和细胞同步化原理进行改进，即在常规低温诱导后，恢复常温培养，时间小于实验材料一个细胞周期，再进行后续有丝分裂临时装片制作。镜检结果显示，实验组有丝分裂指数明显高于对照组(图1、表1)。结果提示低温处理抑制纺锤体形成，细胞分裂就停止在了分裂前期，相当于细胞同步化过程。恢复常温培养一个细胞

周期内，原本阻滞在分裂前期的细胞继续进行分裂，便出现一个明显的细胞分裂高峰，可见数量较多的分裂期细胞。

图1蚕豆根尖实验组有丝分裂图及分裂期细胞

表1蚕豆根尖常温培养与低温诱导细胞的分裂指数

注:经卡方数据检验得:P＜0．05，蚕豆根尖实验组与对照组细胞分裂差异显著。

讨论

（1）恢复常温培养步骤的改进根据上述低温诱导染色体加倍和细胞同步化原理［1～4］，对本实验现有方案改进后，通过比较实验组和对照组的细胞分裂指数，使实验结果直观化、数据化，结果检验更加合理可信。在中学教学中，学生通过该实验方案的操作，加深对低温诱导染色体数目变化本质的理解，并进一步延伸其在生产实践例如细胞同步化中的应用，从而在真正意义上达成