代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸.pdf

摘要

摘要

琥珀酸是一种重要的四碳平台化学品，广泛应用于制药、可降解塑料、膳食、纤维、

金属加工和农药等领域。面对化石燃料枯竭的问题和可持续发展的需要，利用可再生原

料生物合成琥珀酸已成为全世界关注的课题。利用大肠杆菌(Escherichiacoli)发酵生产琥

珀酸受胞内辅因子不平衡的影响，存在得率低、生产强度低、副产物多等问题。本研究

根据不同发酵条件下琥珀酸产量，通过化学计量学分析发现，两阶段发酵条件下E.coli

FMME-N-26高效生产琥珀酸需要借助氧化性三羧酸(TCA)循环为还原性三羧酸(r-TCA)

循环提供足够的ATP和NADH；通过代谢工程策略组合调控胞内ATP与NADH含量，

获得工程菌株E.coliFW-17；最后通过发酵优化策略，促进了菌株E.coliFW-17生产琥

珀酸。主要研究内容如下：

1.化学计量学分析琥珀酸生产：首先，在有氧、厌氧和两阶段发酵条件下分析了菌

株E.coliFMME-N-26的琥珀酸生产情况，发现在菌株E.coliFMME-N-26高效生产琥

珀酸的过程中需要借助TCA循环为r-TCA途径提供一定量的NADH和ATP。其次，研

究了胞内NADH和ATP含量对菌株E.coliFMME-N-26生产琥珀酸的影响，对E.coli

生产琥珀酸的过程进行了化学计量分析，发现部分碳流进入TCA循环用于生成能量与

辅因子，从而解除了能量与辅因子不足而导致的r-TCA合成琥珀酸能力下降的问题。

2.提高胞内ATP和NADH水平促进琥珀酸生产：首先，为了提高胞内ATP水平，

异源表达源自运动假单胞菌(Zymomonasmobilis)的葡萄糖扩散蛋白编码基因Zmglf、过

表达磷酸甘油酸变位酶编码基因pgm和源自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸激

酶编码基因Aspck，分别构建了E.coliFW-1、E.coliFW-2和E.coliFW-3。发酵结果表

明：E.coliFW-1、E.coliFW-2和E.coliFW-3的胞内ATP含量分别提高了17.95%、

100.00%和47.44%。其中，E.coliFW-1和E.coliFW-3的琥珀酸产量比出发菌株E.coli

FMME-N-26分别提高了9.25%和6.55%，但是E.coliFW-2的琥珀酸产量无明显变化。

其次，为了提高胞内NADH水平，敲除乙醇脱氢酶编码基因adhE，构建了菌株E.coli

FW-5；分别过表达磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapA和烟酸磷酸核糖基转移酶编码基因

pncB，构建了菌株E.coliFW-6和E.coliFW-7。发酵结果表明，与E.coliFMME-N-26

相比，E.coliFW-5、E.coliFW-6和E.coliFW-7的胞内NADH含量分别提高了28.13%、

8.57%和17.20%，琥珀酸产量分别提高了6.26%、10.50%和13.09%。最后，为了协调ATP

与NADH供给平衡，借助不同强度RBS组合优化pgm和Zmglf的基因表达水平，以及

gapA和pncB的基因表达水平，获得最优工程菌株E.coliFW-17，琥珀酸产量达到85.67

g∙L-1，比出发菌株E.coliFMME-N-26提高了34.80%。

3.发酵优化促进琥珀酸生产：首先，从玉米浆品牌种类与浓度、厌氧阶段pH中和

剂和厌氧阶段葡萄糖浓度三方面优化了菌株FW-17的两阶段发酵过程。5L发酵罐发酵

结果表明，采用5g∙L-1同盛牌玉米浆为氮源、碳酸镁与碳酸钠协同调节pH、厌氧阶段

控制葡萄糖浓度为1g∙L-1时，琥珀酸的产量和生产强度分别提高至144.36g∙L-1和1.99

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g∙L-1∙h-1。其次，将上述最优发酵条件放大至1000L发酵罐，琥珀酸的产量和生产强度

分别达到了143.58g∙L-1和1.99g∙L-1∙h-1。

关键词：琥珀酸；大肠杆菌；辅因子；代谢工程；发酵优化