毕赤酵母生长过程中的图像分析技术初步研究.pdf

摘要

摘要

在微生物的发酵过程中，主要监测温度、pH、溶氧、底物和产物浓度、呼吸熵及生

物量等变量。根据监测数值的变化可以及时调整发酵策略，从而保障产品的产量与质量。

目前主要通过测量OD600值对微生物细胞进行监测，对形态的关注较少。细胞形态的变

化与细胞生理变化相关，并可能受到工艺条件的影响。毕赤酵母（Pichiapastoris，P.

pastoris）能够以不同的碳源进行生长培养和诱导表达，是制药和生物技术行业中应用最

广泛的酵母物种之一。本研究利用生长过程中获取的不同放大倍数条件下的酵母细胞显

微图像，开发分类方法来获取形态信息，探究酵母细胞在生长过程中的变化。为降低酵

母细胞聚集带来的图像识别难度，对酵母采取分散处理。主要研究内容及结论如下：

（1）在毕赤酵母生长过程中测定并比较了不同的生物量检测方法。本研究首先以

葡萄糖为碳源对毕赤酵母进行培养，分别测定不同时间的OD600值和细胞干重。通过稀

释涂布平板法对活细胞进行计数，发现在稳定期OD600值与平板计数结果的变化趋势非

线性相关。对数期和稳定期的稀释倍数与OD600值之间呈现幂函数关系。分别以葡萄糖、

甘油和甲醇为碳源进行生长培养，获取酵母显微图像并观察在不同时期的生长情况。

（2）建立毕赤酵母细胞分散处理法。将不同时间的菌悬液用pH6，离子浓度为0.07

mol·L-1的磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferSaline，PBS）进行洗涤减少聚集。分别用

不同浓度的吐温20和乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid，EDTA）及不同

-1

时间超声波处理探究分散情况，分散效果最好的分别是0.6%的吐温20、8mmol·LEDTA

和15s超声波处理。进行正交试验得到最佳的条件是0.4%吐温20、8mmol·L-1EDTA、

超声波时间10s，在该条件下毕赤酵母细胞的分散指数为0.21。

（3）采用YOLOv3对放大400倍的显微图像进行分类及初步应用。毕赤酵母在以

甲醇为碳源生长时，酵母细胞出芽数量少聚集情况也较少。对稳定期酵母细胞显微图像

进行标记处理，一共制作了430张带标签的显微图像作为数据集（其中包含单个细胞

2212个、出芽细胞3259个、多个细胞3296个）。模型训练轮数设为200次，最终收敛

到0.05。最终平均准确率为85.40%，单个细胞的准确率为88.06%，出芽细胞的准确率

为81.09%，多个细胞的准确率为87.05%。然后将不同时间的酵母细胞图像输入到优化

好的模型中，提取不同时间显微图像中的不同类别的数量及占比，进行初步应用研究。

（4）构建BAM-ResNet18模型对放大1000倍的显微图像进行分类。用一组深度残

差网络ResNet18替换原始B-CNN模型中的VGGNet作为特征提取器，增进对细粒度特

征的提取，同时在每一层中添加BAM注意力机制，提高分类准确度。阶段一按照单个

细胞、出芽细胞和多个细胞进行三分类。阶段二在阶段一的基础上对出芽细胞和多个细

胞细分，最终进行六分类。阶段一训练轮数50次，最终分类精度为97.83%，阶段二分

类训练轮数80次，最终分类精度为92.31%。与原始的深度学习算法相比，分类精确度

都有提高。

关键词：毕赤酵母；显微图像分析；深度学习；YOLO

I

Abstract

Abstract

Duringthefermentationprocessofmicroorganisms,variablessuchastemperature,pH,

dissolvedoxygen,substrateand