代谢工程改造Paracoc...cans强化降解磺胺甲恶唑.pdf

摘要

摘要

磺胺甲恶唑（SMX）是一种人工合成的广谱类抗生素，具有抑菌消炎的作用，广泛应

用于临床和兽医领域。然而，SMX的过量使用破坏了生态平衡和环境中的微生物群落结构，

也严重危及人类和动物的健康。因此，高效降解环境中的SMX是保证生态安全的迫切需求。

生物法去除SMX是目前应用最广、效率最高和最经济实用的方法，其依赖自然选育的SMX

降解菌（群）实现对SMX的高效降解。然而，自然选育的菌株存在降解效率低和环境适应

能力差等问题。为了进一步提高SMX的生物降解效果，使用代谢工程提高环境微生物降解

SMX的效率是一种具有巨大潜力的新策略。然而，由于缺乏环境微生物中的代谢工程改造

工具和方法，阻碍了代谢工程改造。为了解决这一问题，本研究以一株具有优异脱氮功效的

环境微生物——脱氮副球菌（DYTN-1）为底盘细胞，挖掘并表征了梯度强度启动子，用于

调控SMX降解基因簇（sadA、sadB和sadC）的表达水平，同时优化了黄素单核苷酸（FMN）

还原酶的来源，最终显著提高了P.denitrificansDYTN-1对SMX的降解能力。这是目前国内

外首次利用合成生物技术实现强化降解SMX的研究，构建的SMX降解菌株具有同时去除

SMX和氮污染物的双重功能，为多重污染的环境修复提供了技术参考。具体研究内容如下：

（1）挖掘与表征P.denitrificansDYTN-1的内源性梯度强度启动子。对P.denitrificans

DYTN-1的内源启动子进行评估和表征有助于SMX降解基因的优化表达，从而提高降解效

果。首先从P.denitrificansDYTN-1基因组上分别克隆了启动子PglnA、Pnir、PrhO和Pcs。扩增

的四种启动子对sfGFP表现出了梯度表达强度，其GFP/OD600表达水平比为10:12:14:17。

利用4种内源启动子分别调控sadA、sadB和sadC基因的表达水平，mRNA的表达差异达到

2.1-25.3倍，为后续进一步优化SMX降解途径提供了工具。

（2）SMX降解途径基因的表达水平优化强化SMX降解。异源基因的过表达对宿主菌

的生长代谢都会产生负担，因此系统地优化SMX降解基因的表达水平是提高降解效率和细

胞生长的关键。首先，利用筛选的梯度强度启动子PglnA、Pnir和Pcs对sadA的表达水平进行

优化，三种启动子调控下的sadA菌株均对100mg·L-1SMX的降解效率提高到了18.0%左右，

证明SadA具有降解SMX的作用。由于下游基因sadB未表达引起的代谢限制，中间代谢产

物的积累影响了sadA的表达。使用上述梯度强度启动子通过假操纵子结构优化sadA-sadB的

表达，发现sadB基因的共表达促进了SMX的降解。较低强度启动子PglnA调控时，sadA和

sadB表达的组合优化效果最好，继续提高基因的转录水平反而会降低SMX的降解效率。最

终，菌株PglnA-sadA-PglnA-sadB的SMX降解效率最高，达到27.7%。

（3）FMN还原酶来源和表达水平优化强化SMX降解。FMNH2的供应不足可能是限制

SadA和SadB对SMX降解的主要因素。因此筛选高活性FMN还原酶，并利用梯度强度启动

子优化表达水平，有助于进一步提高降解效果。因此，过表达了SadC及其它五种不同来源

的FMN还原酶，进一步提高了SMX的降解效果。除sadC菌株外，其它五种过表达FMN还

原酶的菌株中，菌株的降解效率和单位生物量的降解能力随着FMN还原酶的表达水平增加

而增加。通过比对分析酶活和降解效率发现，CogA、SadC、PsuK和SutR过表达的菌株中降

解效率随着酶活性的增加而提高。SsuE和RutF具有最高酶活，但是其过表达菌株由于表达

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水平过高，导致SMX的降解效率反而降低。因此，实现代谢调控最优化不仅依靠高酶活，

调控元件的适配性也是调控策略的关键因素。最终，构建的最优菌株P.d-pIAB-P