多元酶簇微粒的构建及其有序固定化.pdf

摘要

摘要

基于多酶级联反应体系的多酶共固定技术能够有效降低载体成本、减少反应体系中

的物质和能量消耗。近年来发展起来的无载体固定化多酶技术，因避免了载体在固定中造

成的空间阻力、遮蔽酶活性位点等问题，在多酶共固定中受到广泛关注。为了充分研究无

载体固定化多酶技术，本研究设计使用原位固定和逐层固定两种方法进行β-葡萄糖苷酶

(β-G)、葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)三元酶的共固定，对比研究了两种方

法下固定化酶的酶学性质，并确定了无载体固定过程中的优化条件。主要内容如下：

(1)制备多酶共固定模板。添加氯化钙、碳酸钠、聚(烯丙胺盐酸)(PAH)和聚(4-苯乙烯

磺酸钠)(PSS)，分别制备不同结构的碳酸钙(CaCO)以及PAH-CaCO和PSS-CaCO微球。

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使用扫描电子显微镜进行形态表征、X射线衍射仪进行结构分析，证明模板构建成功。

(2)进行多酶原位固定和逐层固定。研究了氯化钙和碳酸钠的浓度以及添加顺序、交

联剂浓度以及模板脱除剂浓度对固定化酶载酶量和相对酶活力的影响，得到的多酶原位

固定总载酶量最高为72.573.63%。利用PAH-CaCO3和PSS-CaCO3微球分别进行12种

自组装结构的多酶逐层固定，其中PSS-CaCO--PAH--β-G--HRP--GOD结构中酶的载酶量

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和相对酶活力最高，β-G、GOD和HRP的载酶量分别为75.161.97%、87.704.39%、

85.463.24%，相对酶活力分别为81.802.69%、93.594.68%、90.643.13%。

(3)研究固定化酶的酶学性质和动力学参数。研究了pH和温度对固定化酶活性的影

响，发现固定后HRP的耐酸性提高，pH为5时，在逐层固定中和原位固定中的相对酶活

力分别为游离酶的1.48和1.50倍；固定后β-G和GOD的耐热性提高，逐层固定中β-G

在50-60°C内相对酶活力均达到100%，原位固定中GOD最适温度提高至50°C。进一步

研究固定化酶动力学参数，逐层固定中酶对底物的亲和力和催化效率均大于原位固定，其

中逐层固定后HRP的Km值大于游离酶，且Kcat/Km值为游离酶的1.49倍，表现出良好的

催化性能。

(4)研究固定化酶的重复使用性。固定化酶在8次重复反应后，β-G在原位固定和逐

层固定中的剩余酶活力分别为96.354.82%和96.694.84%，GOD和HRP分别为

69.173.46%和66.683.33%、65.183.26%和62.633.13%，固定化酶表现出良好的重复

使用性。逐层固定中固定化酶完成6次重复反应后，吸光度值最终为0.29，是原位固定

吸光度值的1.40倍，由此证明逐层固定具有良好的应用潜力。

关键词：多酶级联反应；逐层固定；原位固定；载酶量；酶活力

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Abstract

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Themulti-enzymeco-immobilizationtechnologybasedonthemulti-enzymecascade

reactionsystemcanreducethecostofthecarriereffectivelyandminimizetheconsumptionof

materialandenergyinthereactionsystem.Inrec