代谢工程改造大肠杆菌生产软骨素.pdf

摘要

摘要

软骨素是一种重要的糖胺聚糖，被广泛应用于医药、饲料和食品等领域。微生物发

酵法合成软骨素作为一种新兴的软骨素合成策略，具有绿色环保、经济高效等特点。目

前，微生物法合成软骨素存在产量低下的问题，仅通过过表达路径酶及密码子优化异源

基因表达的方法不足以提高代谢路径的碳通量和碳通量，进而高效提升软骨素产量。由

于缺乏高效的代谢工程改造方法调控软骨素所需的碳供应和氮供应，因此需要设计精细

化调控软骨素合成所需碳供应和氮供应的模式化策略，用于提高微生物发酵法合成软骨

素的产量。本研究以大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21STAR（DE3）为宿主，通过引

入E.coliK4来源的软骨素合成路径，优化碳代谢路径与氮代谢路径，显著提高了软骨

素的产量，为软骨素的生产提供了新的策略。主要研究结果如下：

（1）设计与构建软骨素合成路径。首先，由于野生型E.coliBL21STAR（DE3）

不能天然合成软骨素，通过引入E.coliK4来源的UDP-葡萄糖脱氢酶（KfoF）、UDP-

氨基葡萄糖异构酶（KfoA）和软骨素聚合酶（KfoC），构建了软骨素合成路径，使得重

组菌株E.coliCL01能够合成80.1mg·L-1软骨素。其次，通过质谱法，分析鉴定了软骨

素，进而证明了软骨素路径的有效性。最后，通过分析软骨素合成路径中的关键代谢中

间产物，确定了影响软骨素合成的关键瓶颈是碳氮路径供应不平衡。

（2）优化软骨素合成的氮供应路径。首先，通过分析氮供应路径，表明谷氨酰胺

是促进软骨素合成的关键前体。其次，通过过表达谷氨酰胺合成路径关键酶—谷氨酸脱

氢酶（GdhA）和谷氨酰胺合成酶（GlnA），强化了氮供应路径，证明了谷氨酰胺的供

应不足是限制软骨素合成的关键因素之一。再次，通过引入氨基葡萄糖合成酶（GlmS）

突变体（GlmSE14K/D386V/S449P/E524G），减缓了产物的反馈抑制，提高了谷氨酰胺的利用效

率。最后，通过共表达基因gdhA、glnA和glmSE14K/D386V/S449P/E524G，强化了氮供应路径的

效率，使得重组菌株E.coliCL09的软骨素产量达到了184.1mg·L-1，与对照菌株E.coli

CL08相比，提高了39.4%。

（3）优化软骨素合成的碳供应路径。首先，通过过表达软骨素前体UDP-GlcA合

成路径关键酶—葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）、葡萄糖磷酸变位酶（Pgm）、葡萄糖-1-磷

酸尿苷酸转移酶（GalU）和UDP-葡萄糖脱氢酶（KfoF），强化了碳供应路径，其中kfoF

为UDP-GlcA合成路径的关键基因。其次，通过过表达软骨素前体UDP-GalNAc合成路

径关键酶—GlmS、磷酸葡萄糖胺变位酶（GlmM）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶

（GlmU）和UDP-氨基葡萄糖异构酶（KfoA），强化了碳供应路径，其中glmS和glmM

为UDP-GalNAc合成路径的关键基因。最后，通过RBS工程，组合优化了关键基因kfoF、

glmS和glmM，进一步强化了碳供应路径，重组菌株E.coliCL39的软骨素产量达到了

182.1mg·L-1，比对照菌株E.coliCL15提高了49.1%。

（4）平衡软骨素合成的碳供应和氮供应路径。借助具有不同拷贝数的表达载体，

通过组合优化碳供应路径（glmS、glmM和kfoF基因）与氮供应路径（gdhA和glnA基

因），改善软骨素合成所需要的碳供应和氮供应，重组菌株E.coliCL46的软骨素产量

I

摘要

达到了212.5mg·L-1。最终，在5L发酵罐中，重组菌株E.coliCL46的软骨素产量为3.5

g·L-1，比重组菌株E.coliCL01提高了354.5%。

关键词：软骨素；代谢工程；大肠杆菌；RBS调控