蛋白质谷氨酰胺酶的分子改造、表达与应用研究.pdf

摘要

摘要

蛋白质谷氨酰胺酶（EC3.5.1.44，proteinglutaminase，PG）是一种新型的蛋白质

脱酰胺酶，能够特异性地催化底物蛋白或多肽侧链的谷氨酰胺，脱去酰胺基团产生谷

氨酸和氨，从而改善植物基蛋白的溶解度等功能特性，在食品工业中具有应用潜力。

但是目前PG存在酶学性能低、产酶水平与功能研究不足等问题限制其应用推广。因

此，提高PG催化性能与异源表达水平具有重要意义。本研究通过半理性设计的PG分

子改造和基于D-丙氨酸缺陷型表达系统的构建等策略，实现PG在枯草芽孢杆菌168

（Bacillussubtilis168）中的安全高效表达。此外，还评价了PG的脱酰胺作用对小麦

蛋白（WG）的结构性质改善及其在高内相乳液（HIPE）构建中的应用，为植物基蛋

白的功能改善提供指导。主要结果如下：

（1）基于半理性设计的策略对PG进行分子改造以提高催化活性。通过软件

DiscoveryStudio对PG和底物进行分子模拟对接，选取潜在影响PG与底物结合的9个

关键氨基酸位点构建饱和突变体库以筛选高活性PG突变体。得到的PG最佳突变体

A291S在摇瓶水平发酵酶活达到5.10U·mL-1，较初始PG提高了45.71%。酶学性质表

征表明，其比酶活提高了34.04%，Kcat值提高了30.40%，催化效率（Kcat/Km）提高了

27.66%。进一步对初始PG和突变体A291S的分子动力学（MD）模拟分析表明，突变

引入更多的氢键作用可能增加了底物进出口袋的通量进而提高酶活。

（2）构建D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌表达系统促进PG安全、稳定表达。在枯

草芽孢杆菌168中利用Cre/lox重组系统敲除基因组上的丙氨酸消旋酶编码基因(dal)，

构建D-丙氨酸缺陷型表达系统，从而避免发酵过程添加抗生素。菌株表达稳定性研究

表明，D-丙氨酸缺陷型系统展现出较抗生素系统更高的稳定性。利用开发的D-丙氨酸

缺陷型表达系统，获得突变体A291S的发酵酶活为5.25U·mL-1，与改造前的卡那霉素

抗性系统酶活相当（5.10U·mL-1）。在5-L发酵罐的扩大培养中，发酵酶活达到8.15

U·mL-1。

（3）评价PG对WG的结构性质改善及其在HIPE构建中的应用。本研究利用PG

对WG进行脱酰胺作用，随着脱酰胺反应的持续，脱酰胺度（DD）不断增加，48h后

达到70.50%。溶解度随之改善的同时蛋白分子量没有显著变化。选择不同DD的WG

作为稳定剂制备HIPE。与WG相比，脱酰胺WG（DWG）可形成稳定HIPE。此外，

具有适度DD（28.70-40.50%）的DWG形成的HIPE具有更为致密的网络结构、更高

的弹性模量和相对较低的口腔摩擦系数。

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶；半理性设计；D-丙氨酸缺陷型表达系统；脱酰胺作用

I

Abstract

Abstract

Proteinglutaminase(EC3.5.1.44,PG)isadeamidasethathasbeenwidelyconcernedin

recentyears.Itcanspecificallyremovetheamidegroupofglutaminefromthesidechainof

protein,improvingthesolubilityandfunctionalpropertiesofplant-basedproteins.Ithas

potentialapplicationsinthefoodindustry.However,PGislimite